分裂期染色体の脱凝縮を制御する遺伝子の解明

阐明控制有丝分裂染色体解聚的基因

基本信息

批准号：
08274216
负责人：
安田秀世
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08274216/
关键词：
サイクリンB サイクロソームユビキチン E2

项目摘要

M期の終了にはサイクリンBの分解に依存したMPFの不活性化が必要であり、サイクリンBはM期中期から後期の移行期に分解される。このサイクリンBの分解はユビキチン化に依存したプロテアソーム系を介して行われると考えられている。ユビキチン化はE1,E2およびAPC(Anaphase-promotingcompex)またはサイクロソームと呼ばれる複合酵素系で行われると考えられているが未だその酵素活性の調節機構は明らかになっていない。そこで哺乳動物細胞を用いたサイクリンBのユビキチン化の系の開発とともに、ユビキチン化酵素の同定を試みた。バキュロウイルス系で発現させたGST-サイクリンB融合蛋白質/cdc2複合体、ビオチン化ユビキチンを基質として、マウスユビキチン活性化酵素(E1)とHeLa細胞の抽出液を酵素源としたin vitroサイクリンBユビキチン化の系を確立した。この系に大腸菌で発現させた各種ヒトユビキチン輸送蛋白(E2)を添加したところUBC4とUBCH5はサイクリンBのユビキチン化を著しく促進したが、UBC3、E2-EPFには促進効果はなかった。一方最近、クラム、XenopusサイクリンB特異的E2-C,UBCxが単離された。我々はそのヒトホモログhE2-Cを単離し、サイクリンBのユビキチン化を調べたところ活性は分裂期抽出液存在下で高く、しかもサイクリンB単量体よりもサイクリンB/cdc2複合体が良い基質となった。そのことからここで単離したhE2-CはサイクリンB特異的E2として働き、M期特異的E3の存在下にサイクリンBのユビキチン化を行うと考えられた。一方染色体脱凝縮が温度感受性であるtsTM13細胞はこのユビキチン化酵素活性が低いとの結果が得られた。即ちこの変異細胞では高温でサイクリンBのユビキチン化が欠損していることによりM期からG1期への移行が行われないと考えられる。

M期的终止需要MPF失活，这依赖于cyclin B的降解，而cyclin B在M期中期到后期的过渡过程中被降解。细胞周期蛋白 B 的这种降解被认为是通过泛素化依赖性蛋白酶体系统发生的。泛素化被认为是由称为E1、E2和APC（后期促进复合体）或环体的复杂酶系统进行的，但酶活性的调节机制尚不清楚。因此，我们尝试开发一种利用哺乳动物细胞对细胞周期蛋白B进行泛素化的系统，并鉴定泛素化酶。以小鼠泛素激活酶（E1）和HeLa细胞提取物为酶源，以杆状病毒系统表达的GST-cyclin B融合蛋白/CDC2复合物和生物素化泛素系统为底物，建立了体外细胞周期蛋白B泛素化。当在大肠杆菌中表达的各种人类泛素转运蛋白（E2）添加到该系统中时，UBC4和UBCH5显着促进细胞周期蛋白B泛素化，但UBC3和E2-EPF没有促进作用。另一方面，最近分离出蛤、爪蟾细胞周期蛋白B特异性E2-C、UBCx。我们分离了它的人类同源物 hE2-C，并研究了 cyclin B 的泛素化。我们发现，在有丝分裂提取物存在下，其活性很高，并且 cyclin B/cdc2 复合物是比 cyclin B 单体更好的底物。这表明此处分离的 hE2-C 充当细胞周期蛋白 B 特异性 E2，并在 M 期特异性 E3 存在的情况下泛素化细胞周期蛋白 B。另一方面，结果表明，染色体解缩对温度敏感的tsTM13细胞具有较低的泛素化酶活性。换句话说，认为该突变细胞由于高温下细胞周期蛋白B的泛素化缺陷而没有经历从M期到G1期的转变。