生物分子モーターの構造・機能の1分子動態解析研究

生物分子马达结构与功能的单分子动力学分析研究

• 批准号: 10175211
• 负责人: 安藤 敏夫
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10175211/
• 关键词: ミオシン; アクチン; ATP; 原子間力顕微鏡; 分子モータ; 滑り運動

アクトミオシンモーターのエネルギーはATPの加水分解で供給される。この化学エネルギーがどのようにして力学的エネルギーに変換されるのか、また、ATPase反応のどのステップが力学的現象を生むのか、更には、力学的性質(発生する力の大きさや滑り速度)が何によって決定されているのか、など多くの興味ある問題が未解決のままである。本研究では先ず、ミオシン頭部がATPを結合・分解するときにミオシン頭部にどのような力学的応答が生ずるかを、原子間力顕微鏡を用いて1分子レベルで調べた。カンチレバー探針先端に捕捉されたHMM1分子が基板に固定されたATPと結合した直後のカンチレバーの応答を計測した。驚いたことに、カンチレバーが振動する現象が観察された。カンチレバーを動かしているものはHMM以外には無いので、HMM分子自身が振動していると判断せざるを得ないが、他の可能性も残されている。この振動がATP加水分解のエネルギーによってもたらされているかどうかを調べるために、ATPをADPで置き換えた。ADPの場合には振動は全く観察されなかった。HMMがATPと結合・解離を繰り返すために振動が現れる可能性もあり得るが、ATP基板を下げていっても振動が続くことからこの可能性は否定された。HMMの2つの頭部が交互にATPと結合・解離をするために振動が現れる可能性が残されているが、単頭のHMMで振動が現れるかどうかを今後調べる。アクトミオシン系の滑り速度・力が何によって決定されているかを次に調べた。様々な基質(7種類のMg-NTP、4種類のMe-ATP)とイオン強度を変えて、NTP加水分解反応と滑り運動を同じ条件で観察した。その結果、滑り速度はNTPase反応のアクチン濃度に対するKmに、すべての条件下で比例することを発見した。最大活性は滑り速度と無関係であった。力については、滑り運動中の力はすべての条件でほぼ一定であり、滑り速度ゼロのときに発生している力は条件に依存した。その依存性にはNTPase反応のKmや最大活性とのシステマティックな関係が見出されなかった。これらを説明できるモデルを構築・分析して、弱い結合中間体におけるミオシン頭部とアクチンとの間で生ずる内部負荷が滑り速度を決定していることを解明した。

肌动球蛋白马达的能量由 ATP 水解提供。这种化学能是如何转化为机械能的，ATP酶反应的哪一步产生了机械现象，以及机械特性是什么（产生的力的大小和滑动速度），许多有趣的问题仍然没有解决，比如它是否有效？是由在这项研究中，我们首先使用原子力显微镜来检查肌球蛋白头部在单分子水平上结合和分解 ATP 时发生的机械反应。在悬臂尖端捕获的 HMM1 分子与固定在基板上的 ATP 结合后，立即测量悬臂的响应。令人惊讶的是，观察到悬臂振动的现象。由于除了 HMM 之外没有任何东西可以移动悬臂，因此我们必须得出结论，HMM 分子本身正在振动，但其他可能性仍然存在。为了研究这种振荡是否是由 ATP 水解能量引起的，将 ATP 替换为 ADP。在 ADP 的情况下没有观察到振荡。振荡的发生可能是因为 HMM 反复与 ATP 结合和解离，但这种可能性被排除，因为即使 ATP 底物降低，振荡仍然持续。由于 HMM 的两个头交替与 ATP 结合和解离，因此有可能会出现振动，但我们将研究单头 HMM 中是否会出现振动。接下来，我们研究了决定肌动球蛋白系统滑动速度和力的因素。使用不同的底物（7种Mg-NTP和4种Me-ATP）和离子强度，在相同条件下观察NTP水解反应和滑动运动。结果，我们发现在所有条件下滑动速度与 NTPase 与肌动蛋白浓度反应的 Km 成正比。最大活动与滑动速度无关。至于力，滑动运动时的力在所有条件下几乎恒定，零滑动速度时产生的力取决于条件。依赖性与 NTPase 反应的 Km 或最大活性之间没有发现系统关系。通过构建和分析可以解释这些的模型，我们发现弱结合中间体中肌球蛋白头和肌动蛋白之间产生的内部负载决定了滑动速度。