蛍光プローブ走査型ナノ顕微鏡によるタンパク質表面物性の研究

使用荧光探针扫描纳米显微镜研究蛋白质表面特性

• 批准号: 08680717
• 负责人: 安藤 敏夫
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08680717/
• 关键词: 原子間力顕微鏡; 蛍光プローブ; タンパク質表面物性; AFM; カンチレバ-

原子間力顕微鏡(AFM)法は液中にある生体試料の形状をナノメータの分解能で観察できる唯一の方法である。他方、タンパク質の局所に導入した蛍光プローブからの信号(強度やスペクトルなど)の観察によりその局所部位の物理化学的性質を調べることができる。しかし、蛍光法ではごく一部の局所情報しか得られないという重大な欠点がある。AFM探針先端に蛍光プローブを導入し、タンパク質表面上の走査各点で蛍光信号を測定する。その蛍光信号の一意的解釈に基づき、タンパク質表面全体に亙る物理化学的性質をマッピングする。以上が本研究の目指すところである。この目標の実現のために以下の研究を行った。1.明るい蛍光顕微鏡(Olympus,IX70)に組み込まれたAFM装置の製作。走査速度を従来のものより十倍程度速くする工夫を行い、装置はほぼ完成した。2.パルス励起光源の蛍光顕微鏡への組み込み。3.タンパク質形状とフォトンカウンティングの同時計測のためのプログラムの開発。4.蛍光性分子1分子からの光子数の測定。超高圧水銀ランプを光源、フォトマルを検出器として計測したところ、1秒間当たり1万5千個のフォトンが検出器まで来ていることを確認した。但し、フォトマルの量子効率は低く約200個しか検出されなかった。量子効率が80%と高いアバランシェフォトダイオードを購入する予定であったが、価格が3倍以上引き上げられたため入手することができなかった。5.蛍光性分子数分子の探針先端への導入法の確立。短いPEGをスペーサーとしてアミノ化した探針に蛍光性分子を導入する方法を確立した。装置全体はほとんど完成したので、アバランシェフォトダイオードを将来入手することができれば、本研究の目標とするタンパク質表面の物性マップ観察が可能になると期待される。

原子力显微镜（AFM）是唯一能够以纳米分辨率观察液体中生物样品形状的方法。另一方面，通过观察局部引入蛋白质的荧光探针的信号（强度、光谱等），可以研究该局部位点的物理化学特性。然而，荧光方法的一个主要缺点是它仅提供有限数量的局部信息。在 AFM 探针尖端引入荧光探针，在蛋白质表面的每个扫描点测量荧光信号。基于对荧光信号的独特解释，我们绘制了蛋白质表面的理化特性。这些是本研究的目的。为了实现这一目标，我们进行了以下研究。 1. 制造集成到明亮荧光显微镜（奥林巴斯，IX70）中的 AFM 装置。经过努力将扫描速度提高到传统设备的约10倍后，该设备已基本完成。 2. 将脉冲激发光源并入荧光显微镜。 3. 开发同时测量蛋白质形状和光子计数的程序。 4.测量一个荧光分子的光子数。使用超高压汞灯作为光源、Photomaru作为检测器进行测量时，确认每秒有15,000个光子到达检测器。然而，Photomaru的量子效率较低，仅检测到约200个粒子。我原本打算购买量子效率高达80%的雪崩光电二极管，但由于价格上涨了三倍以上而未能购买。 5.建立将多种荧光分子引入探针尖端的方法。我们建立了一种使用短 PEG 作为间隔基将荧光分子引入胺化探针的方法。整个装置已经基本完成，因此如果未来能够获得雪崩光电二极管，则有望能够观测到蛋白质表面的物理性质图，这也是本次研究的目标。