タンパク質の分子機能動態及び場のリアルタイムイメージングを目指して

瞄准蛋白质分子功能动力学和场的实时成像

• 批准号: 14654071
• 负责人: 安藤 敏夫
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14654071/
• 关键词: 原子間力顕微鏡; AFM; 高速AFM; リアルタイムイメージング; ナノバイオロジー; モータータンパク質; 走査型プローブ顕微鏡; ナノ動態; タンパク質; 生物分子機械

我々が世界に先駆けて開発した高速原子間力顕微鏡をタンパク質などの生体高分子の機能ナノ動態撮影に実用化する上で障害となる装置上の問題点を発見・解決するとともに、特定の試料対象に対してその基板への固定法などを開発し、高速原子間力顕微鏡をタンパク質の新しい研究手段にすることを本研究は目指している。対象試料をモータータンパク質系に絞って研究を進めてきた。モータータンパク質(ダイニンC、ミオシンV)が単独に在る場合には、マイカ表面を改変せず、また、溶液条件を特別なものにしなくとも、これらの蛋白質は緩やかにマイカ表面に吸着し、分子内のかなりの部分がマイカ表面から自由であった。従って、ATPase反応にともなう構造変化を比較的容易にイメージングできた。ダイニンCでは、ストークとヘッド部はATPの影響が見られないのに対して、ステム部はATP存在下で2つの位置を行ったり来たりする様子が観察された。その頻度はATPターンオーバー時間にほぼ等しく、ステムの運動がATPase反応に共役していることは明らかである。ミオシンVのATPase活性は極めて低いので、構造形態変化を繰り返し捉えることは難しい。そこで、Caged-ATPに紫外線を照射しATPを放出する前後をイメージングする方法でATPase反応にカップルした構造形態変化を捉えた。紫外線照射後素早く頭部が大きく屈曲し、1-2秒の内にもとのまっすぐな形態に戻った。装置の改良により、ATP存在下でアクチンフィラメントとミオシンVが弱く相互作用する系についても、系を乱すことなく、イメージングすることが可能になった。現在この系に集中して、ミオシンVの動的挙動の研究を進めている。ダイニンCとマイクロチュービュルが共存する系については未だ着手していない。

我们在世界上首次开发的高速原子力显微镜用于蛋白质等生物大分子的功能性纳米动力成像，除了发现和解决阻碍其实用化的设备问题外，我们还研究方向是开发一种将蛋白质固定在基质上的方法，并使用高速原子力显微镜作为研究蛋白质的新手段。我们的研究重点是运动蛋白系统。当运动蛋白（动力蛋白C、肌球蛋白V）单独存在时，这些蛋白会慢慢吸附到云母表面并形成分子，而无需修饰云母表面或使用特殊的溶液条件，内部有相当一部分游离于云母表面。因此，伴随 ATP 酶反应的结构变化可以相对容易地成像。在动力蛋白 C 中，虽然茎和头没有表现出 ATP 的影响，但观察到茎在 ATP 存在的情况下在两个位置之间来回切换。该频率大约等于 ATP 周转时间，并且很明显，茎运动与 ATP 酶反应耦合。由于肌球蛋白V的ATP酶活性极低，因此很难重复检测结构和形态变化。因此，我们通过用紫外线照射笼状 ATP 并在其释放 ATP 之前和之后对其进行成像，捕获了与 ATP 酶反应相关的结构和形态变化。受到紫外线照射后，头部迅速显着弯曲，并在1-2秒内恢复到原来的笔直形状。设备的改进使得在不干扰系统的情况下对肌动蛋白丝和肌球蛋白 V 在 ATP 存在下微弱相互作用的系统进行成像成为可能。目前，我们正在关注这个系统，对肌球蛋白V的动态行为进行研究。我们尚未开始研究动力蛋白 C 和微管共存的系统。

项目成果

安藤敏夫: "生体分子の高速ダイナミクス撮影4章4節(P.395-406)in「ナノバイオロジーの最前線」"シーエムシー出版. 439 (2003)

Toshio Ando：“《纳米生物学前沿》中的生物分子高速动态成像第 4 章第 4 节 (P.395-406)”CMC Publishing 439 (2003)。

T.Andp, N.Kodera, Y.Naito, T.Kinoshita, K.Furuta, YY.Toyoshima: "A High-speed Atomic Force Microscope for Studying Biological Macromolecules in Action"ChemPhyschem. 4. 1196-1202 (2003)

T.Andp、N.Kodera、Y.Naito、T.Kinoshita、K.Furuta、YY.Toyoshima：“用于研究生物大分子作用的高速原子力显微镜”ChemPhyschem。

T.Ando: "A high-speed atomic force microscope for studying biological macromolecules in action"Proc. of the European Medical & Biological Engineering Conference. 3(Part1). 22-30 (2002)

T.Ando：“用于研究活动中生物大分子的高速原子力显微镜”Proc。

安藤敏夫: "高速原子間力顕微鏡-生体分子のナノダイナミクス撮影"応用物理. 72(10). 1304-1308 (2003)

Toshio Ando：“高速原子力显微镜 - 生物分子的纳米动力学成像”应用物理学 72(10) (2003)。

T.Ando, N.Kodera, D.Maruyama, et al.: "A high-speed atomic force microscope for studying biological macromolecules in action"Jap. J. Appl. Phys.. 41. 4851-4856 (2002)

T.Ando、N.Kodera、D.Maruyama 等：“用于研究生物大分子活动的高速原子力显微镜”Jap。