シャペロニン機能動態のナノイメージング

伴侣蛋白功能动力学的纳米成像

• 批准号: 14037220
• 负责人: 安藤 敏夫
• 金额: $ 2.56万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14037220/
• 关键词: GroEL; GroES; シャペロニン; 原子間力顕微鏡; AFM; 機能動態

シャペロニンは基質ペプチドの折りたたみを支援する大きく構造を変化させる分子モーターである。その構造変化のダイナミクスはATPase反応の進行、基質ペプチドとの結合と連携している。その連携の仕方・仕組みを理解することが本研究の最終目標である。本研究では、研究代表者が開発した高速原子間力顕微鏡(AFM)を活用し、GroEL(+GroES+基質)の構造変化の動態を、ナノメーターの解像度で且つ映像として捉えることを目指した。初めて経験する試料系であり、且つ、比較的小さいタンパク質であることなどの理由により、本年度においてはまずは像を撮り、そこで見出された問題点を解決していくことから着手した。孤立した小さいタンパク質のAFM観察では、探針・試料間にかかる力によって起こる試料の動きが無視できなくなることと、探針先端の曲率半径の大きさが像に与える影響が大きくなるという問題点が一般にある。実際、GroELでも同様であった。以下に、行った改良、得られた成果をまとめる。1)探針・試料間にかかる力を軽減化する様々な工夫を行った。その結果、フィードバック制御に動的特性を持たせることにより、力の軽減化に成功した。2)探針は電子線を1点に当てるEBD法により作成するが、その先端曲率半径はベストの条件でもせいぜい8nm程度である。そこで、アルゴンガス存在下でのプラズマエッチングを行ったところ、4nmにまで細くすることに成功した。3)上記の工夫により、マイカ表面上に一様に立ったGroELの像をきれいに撮ることができるようになった。中心の穴やサブユニットまで解像することができた。GroELの濃度と像との関係を調べたところ、薄い場合には単層リングが多く、濃くすると2重リングになることを見出した。4)ATP存在下、非存在下で像ととり、単層GroELの形状変化を、高さ及び幅の変化として測定した。非存在下で高さは7.6nm、存在下では6.7nmになり、ATPの添加で約1nm低くなることが見出された。この変化は予想された方向と逆であった。幅も若干小さくなる傾向にあった。

伴侣蛋白是分子马达，可经历较大的构象变化，有助于底物肽的折叠。结构变化的动态与 ATP 酶反应的进展以及与底物肽的结合有关。这项研究的最终目标是了解这种合作是如何运作的。在这项研究中，我们的目标是使用首席研究员开发的高速原子力显微镜 (AFM) 以纳米分辨率的图像形式捕捉 GroEL (+GroES+基板) 结构变化的动态。因为这是我们第一次体验这个样本系统，而且它是一种相对较小的蛋白质，所以今年我们从拍摄图像并解决其中发现的问题开始。 AFM观察孤立的小蛋白质存在的问题是，针尖与样品之间施加的力引起的样品移动不可忽视，并且针尖的曲率半径对图像影响较大。常见。事实上，GroEL 也是如此。以下是所做的改进和所获得的结果的摘要。 1) 采取了各种措施来减少施加在探头和样品之间的力。结果，我们通过赋予反馈控制动态特性，成功地减少了力。 2）尖端采用EBD法制作，将电子束聚焦在一点上，但尖端的曲率半径在最佳条件下最多约为8 nm。因此，通过在氩气存在下进行等离子蚀刻，我们成功地将厚度减少到4 nm。 3）通过上述创新，可以拍摄均匀站立在云母表面的GroEL的清晰图像。我们甚至能够解析中心孔和子单元。当我们研究GroEL的浓度与图像的关系时，我们发现当它很薄时，有很多单层环，当它很厚时，有双层环。 4) 在存在和不存在 ATP 的情况下拍摄图像，并测量单层 GroEL 形状的变化作为高度和宽度的变化。结果发现，在不存在ATP的情况下，高度为7.6 nm，在存在ATP的情况下，高度为6.7 nm，并且随着ATP的添加，高度降低了约1 nm。这一变化与预期的相反。宽度也趋于变得稍小。

项目成果

N.Kodera, T.Kinoshita, T.Ito, T.Ando: "High-resolution imaging of myosin motor in action by a high-speed atomic force microscope"Proc. of the Fujiwara International Symposium on Molecular And Cellular Aspects of Muscle Contraction. (In press). (2003)

N.Kodera、T.Kinoshita、T.Ito、T.Ando：“通过高速原子力显微镜对运动中的肌球蛋白运动进行高分辨率成像”Proc。

T.Ando: "A high-speed atomic force microscope for studying biological macromolecules in action"Proc. of the European Medical & Biological Engineering Conference. 3(Part1). 22-30 (2002)

T.Ando：“用于研究活动中生物大分子的高速原子力显微镜”Proc。