原子間力顕微鏡によるアクトミオシン系の1分子力学特性の研究

利用原子力显微镜研究肌动球蛋白系统的单分子机械特性

• 批准号: 06680647
• 负责人: 安藤 敏夫
• 金额: --
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06680647/
• 关键词: 1分子生理学; モーター蛋白質; 原子間力顕微鏡; ミオシン; ATP1分子の可視化; ミオシン1分子の可視化; 生体運動; 滑り運動

蛋白質モーターであるミオシンの力学現象と化学反応とのカップリングダイナミッスクを解明するために、力学・ATPase反応を1分子のレベルで直接計測することを目的とした。この1分子直接計測の実行には様々な要素技術が必要であり、また最終的なカップリングの計測までには相当の時間を要する。本研究では要素技術を開発することに重点をおいて、次年度以降に進める本格的な研究の準備をすることにした。以下のような要素技術の開発に成功した。1.蛋白質に非特異的に結合しない蛍光性超微粒子の調製。2.ミオシンの運動活性を損なわない蛍光性超微粒子のミオシンへの導入。3.ATP分子をコートした蛍光性超微粒子の調製。4.エバネッセント証明によるATP1分子のターンオーバーの可視化。5.アクチンフィラメントの基板への配向固定。6.1分子による滑り力を検知できる柔らかいカンチレバ-の作製。7.カンチレバ-探針先端へのミオシン1分子の捕捉。これらの要素技術の確立により、原子間力顕微鏡を用いてミオシン1分子が発生する力を計測でき、ミオシン1分子の滑り運動も観察でき、またミオシン1分子のATPase反応を追跡できる。現在まだ確立していないものとして、ミオシン1分子のブラウン運動を抑制する技術がある。ミオシンのアクチンへの親和性はATP存在下では低いので、ミオシンはアクチンから容易に解離して視野から逃げてしまう。磁性超微粒子をミオシンに結合できれば、磁場によりミオシンを軽く捕捉しておくことが可能になる。現在この研究を進めている。柔らかいカンチレバ-を作製できるようにはなったが、効率がはなはだ悪い。この点も改良の必要がある。

为了阐明肌球蛋白（一种蛋白质马达）的机械现象和化学反应之间的耦合动力学，我们旨在直接测量单分子水平的动力学和 ATP 酶反应。执行这种单分子直接测量需要各种基础技术，并且需要相当长的时间才能最终测量耦合。在这项研究中，我们决定重点开发基础技术，并为明年起进行全面研究做准备。我们成功开发了以下基本技术。 1. 不与蛋白质非特异性结合的荧光超细颗粒的制备。 2.将荧光超细颗粒引入肌球蛋白中，不会损害肌球蛋白的运动活性。 3. ATP分子包覆荧光超细颗粒的制备。 4. 使用消逝证明可视化 ATP1 分子周转。 5.肌动蛋白丝定向固定到基底上。 6.1 制作可检测分子滑动力的软悬臂梁。 7. 在悬臂尖端捕获单个肌球蛋白分子。随着这些基本技术的建立，现在可以使用原子力显微镜测量单个肌球蛋白分子产生的力，观察单个肌球蛋白分子的滑动运动，并跟踪单个肌球蛋白分子的ATP酶反应。一项尚未建立的技术是抑制单个肌球蛋白分子的布朗运动的能力。由于肌球蛋白在 ATP 存在下对肌动蛋白的亲和力较低，因此肌球蛋白很容易与肌动蛋白解离并逃离视野。如果磁性超微粒可以与肌球蛋白结合，则可以利用磁场轻轻地捕获肌球蛋白。这项研究目前正在进行中。虽然制造软悬臂梁已经成为可能，但效率极低。这一点也需要改进。