脂質転移タンパク(LTP)の高次構造と脂質結合部位の解析

脂质转移蛋白（LTP）的高阶结构和脂质结合位点分析

• 批准号: 06760114
• 负责人: 佐藤 敦
• 金额: $ 0.51万
• 依托单位: Hokkaido Tokai University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06760114/
• 关键词: 脂質転移タンパク; 核磁気共鳴スペクトル; 核オーバーハウザ-効果

1.タバコ脂質転移タンパク質(Tob-LTP)遺伝子を組み込んだ大腸菌(JM83株)を用い、Tob-LTPとマルトース結合タンパク質との融合タンパク質を発現させた。発現した融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、さらに酵素による切断およびFPLCによるゲル濾過などの行程を経て、Tob-LTPを精製した。その結果、培養液1Lより得られる大腸菌菌体から、約1.3mgのTob-LTPを得られた。この発現系により以後の実験に用いるTob-LTPを安定して供給することが可能になった。2.一次および二次構造解析に用いる^<15>N標識Tob-LTPの発現を試みた。ミニジャーファメンター中でM9合成培地を用いて大腸菌の培養ならびに融合タンパク質の発現を行った。その結果、今回行った培養条件では大腸菌の生育は不良で、また得られた菌体破砕液の電気泳動のタンパク質染色およびウエスタンブロットで融合タンパク質の発現は認められなかった。現在、培地組成等の要因を検討中である。3.1.に示した発現系より得られたTob-LTPを用いて核磁気共鳴スペクトルの測定を行った。その結果、一次元スペクトルは測定できたものの、高次構造の決定に必須である二次元スペクトル(^1H-^1HCOSY、NOESY)は測定できなかった。これは長時間の測定の際にタンパク質が会合し沈澱を生じることによるものであり、現在、会合を防ぐために加える還元剤の種類および濃度、溶液のpH等を検討中である。

1.利用含有烟草脂质转移蛋白（Tob-LTP）基因的大肠杆菌（菌株JM83），表达了Tob-LTP和麦芽糖结合蛋白的融合蛋白。表达的融合蛋白通过亲和层析纯化，并进一步进行酶切和FPLC凝胶过滤等步骤来纯化Tob-LTP。结果，从1L培养液中获得的大肠杆菌细胞中获得约1.3mg的Tob-LTP。该表达系统使得稳定供应Tob-LTP用于后续实验成为可能。 2.我们尝试表达^ 15 N标记的Tob-LTP，其用于一级和二级结构分析。培养大肠杆菌并使用 M9 合成培养基在迷你发酵罐中表达融合蛋白。结果，在本次使用的培养条件下，大肠杆菌生长不良，并且在所得细菌细胞裂解物的电泳蛋白染色和Western blotting中没有观察到融合蛋白的表达。我们目前正在调查培养基成分等因素。使用从3.1所示的表达系统获得的Tob-LTP测量核磁共振谱。因此，虽然我们能够测量一维光谱，但我们无法测量二维光谱（^1H-^1HCOSY，NOESY），而二维光谱对于确定高阶结构至关重要。这是因为蛋白质在长期测量过程中会发生缔合和沉淀，目前我们正在研究要添加的还原剂的类型和浓度以及溶液的 pH 值以防止缔合。