自己免疫および真菌感染の成立機構の両者に働く遺伝子の機能解析

自身免疫相关基因的功能分析及真菌感染建立机制

基本信息

批准号：
15019070
负责人：
松本満
金额：
$ 3.58万
依托单位：
The University of Tokushima
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15019070/
关键词：
AIRE 自己免疫疾患胸腺 PHD ユビキチン

项目摘要

AIRE (autoimmune regulator)は遺伝性の自己免疫疾患APECEDの原因過伝子である。AIREは胸腺髄質上皮細胞に強く発現していることから、自己寛容の成立過程に重要な役割をはたすと考えられるが、そのメカニズムについては不明な点が多い。本研究ではAIREが2つのPHDドメインをもつことに着目し、E3 ligaseとしてのAIREの機能を解析した。すなわち、AIREの2つのPHD fingerドメイン(PHD1およびPHD2)についてGST融合蛋白を作製し、in vitro ubiquitylation assayを行った。その結果、N末側のPHDドメイン(PHD1)がE3 ligase活性をもつことが明らかになった。PHD1によるAIREのE3 ligase活性は、バキュロウィルス発現系を用いて作製したAIRE全長蛋白でも確認した。次いでAIREのE3 ligase活性とAPECED発症との関連を検討する目的で、APECED症例で報告されているPHD1 missense mutant (C311YおよびP326Q)を作製し、in vitro ubiquitylation assayを行ったところ、これらのdisease mutantでは野生型AIREと比較しE3 ligase活性が著明に減弱していた。これい対して、PHD1 disease mutantのGal4-binding assayによる転写活性化能は野生型と差異を認めなかった。Disease mutantであるC311YおよびP326QでE3 ligase活性が減弱していることから、AIREのE3 ligase活性が自己寛容の成立過程に重要な役割をはたしていることが示唆され、今後はAIREによってユビキチン化される基質の同定が重要な課題と思われる。

AIRE（自身免疫调节剂）是遗传性自身免疫性疾病的原因。由于AIRE在胸腺髓上皮细胞中强烈表达，因此人们认为它在自我耐受过程中起着重要作用，但是关于其机制有许多未知数。在这项研究中，我们关注AIR具有两个PHD领域的事实，并分析了AIRE作为E3连接酶的功能。也就是说，为AIRE的两个PHD指域（PHD1和PHD2）制备了GST融合蛋白，并进行了泛素化测定法。结果，揭示了N末端PHD结构域（PHD1）具有E3连接酶活性。 PHD1的AIRE的E3连接酶活性也通过使用杆状病毒表达系统产生的AIRE全长蛋白证实。接下来，为了研究AIRE的E3连接酶活性与在APECED病例中报道的PHD1错义突变体（C311Y和P326Q）之间的E3连接酶活性之间的关联，并在体外测定了泛素化，并且在这些疾病中，E3连接酶的泛酶活性在这些疾病中与野生型杂种相比显着降低。相反，PHD1疾病突变体通过GAL4结合测定的转录能力与野生型的能力没有差异。疾病突变体C311Y和p326Q中E3连接酶活性的衰减表明，AIRE的E3连接酶活性在自我耐受过程中起着重要作用，并且看来，AIRE泛滥的底物的鉴定将来是一个重要的问题。