プロテオミクスの手法を用いた自己免疫疾患の発症に関わる胸腺内蛋白同定の試み

尝试利用蛋白质组学技术鉴定参与自身免疫性疾病发展的胸腺内蛋白质

• 批准号: 15659116
• 负责人: 松本 満
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15659116/
• 关键词: AIRE; 自己免疫疾患; 胸腺; PHD; ユビキチン; 自己抗原; ノックアウトマウス

AIRE(autoimmune regulator)は遺伝性の自己免疫疾患APECEDの原因遺伝子である。AIREは胸腺髄質上皮細胞に強く発現していることから、自己寛容の成立過程に重要な役割をはたすと考えられるが、そのメカニズムについては不明な点が多い。本研究ではAIRE.2つのPHDドメインをもつことに着目し、E3 ligaseとしてのAIREの機能を解析した。すなわち、AIREの2つのPHD fingerドメイン(PHD1およびPHD2)についてGST融合蛋白を作製し、in vitro ubiquitylation assayを行った。その結果、N末側のPHDドメイン(PHD1)がE3 ligase活性をもつことが明らかになった。PHD1によるAIREのE3 ligase活性は、バキュロウィルス発現系を用いて作製したAIRE全長蛋白でも確認した。次いでAIREのE3 ligase活性とAPECED発症との関連を検討する目的で、APECED症例で報告されているPHD1 missense mutant(C311YおよびP326Q)を作製し、in vitro ubiquitylation assayを行ったところ、これらのdisease mutantでは野生型AIREと比較しE3 ligase活性が著明に減弱していた。これに対して、PHD1 disease mutantのGal4-binding assayによる転写活性化能は野生型と差異を認めなかった。Disease mutantであるC311YおよびP326QでE3 ligase活性が減弱していることから、AIREのE3 ligase活性が自己寛容の成立過程に重要な役割をはたしていることが示唆され、今後はAIREによってユビキチン化される基質の同定が重要な課題と思われる。他方、AIREノックアウトマウスについては、その免疫学的性状について解析し、AIREが胸腺上皮細胞による自己抗原の発現過程に作用する可能性を報告した。現在、AIRE欠損状態における胸腺上皮細胞MHC class II結合ペプチドの網羅的解析を行い、そのメカニズムを検討中である。

AIRE（自身免疫调节剂）是遗传性自身免疫性疾病的顶点的遗传基因。由于AIRE在牙周细胞中强烈表达，因此人们认为它在自我耐受的过程中起着重要作用，但是有许多未知的机制。在这项研究中，我专注于在AIRE中拥有两个PHD领域，并将AIRE的特征分析为E3连接酶。也就是说，在AIRE中为两个PHD指域（PHD1和PHD2）生产了GST融合蛋白，并进行了体外泛素化测定法。结果，发现N末端的PHD结构域（PHD1）具有E3连接酶活性。通过使用真空病毒表达系统产生的AIRE总体蛋白质，还证实了AIR的E3连接酶活性。接下来，为了考虑E3连接酶活性与APECED发作之间的关系，PHD1错义突变体（C311Y和P326Q）是在体外造成的，当时这些疾病突变体是在体外。连接酶的活性显着削弱。另一方面，PHD1疾病突变体中GAL4结合测定的转移激活能力并未识别出荒野。由于E3连接酶的活性被C311Y和P326Q（这是疾病突变体）削弱，因此建议AIRE的E3连接酶活性在自我耐受的过程中起重要作用，并且Aire将来会使用它识别底物似乎是一个重要的问题。另一方面，Aire敲除小鼠分析了其免疫学特性，并报告说AIRE可以在具有胸腺上皮细胞的自我抗原细胞的过程中作用。当前，正在进行对AIRE缺乏症中MHC II类结合肽的全面分析，并正在考虑该机制。

项目成果

AIRE functions as an E3 ubiquitin ligase.

• DOI: 10.1084/jem.20031291
• 发表时间: 2004-01-19
• 期刊: The Journal of experimental medicine
• 作者: Uchida D;Hatakeyama S;Matsushima A;Han H;Ishido S;Hotta H;Kudoh J;Shimizu N;Doucas V;Nakayama KI;Kuroda N;Matsumoto M
• 通讯作者: Matsumoto M