Poli遺伝子導入トランスジェニックマウスにおけるウレタン誘発肺発がんの解析:損傷乗り越え型DNA合成酵素遺伝子Poltは肺発がん耐性遺伝子Par2と同一か?

Poli转基因小鼠乌拉坦诱发肺癌分析：损伤存活DNA合酶基因Polt与肺癌抗癌基因Par2相同吗？

基本信息

批准号：
16021258
负责人：
李康弘
金额：
$ 2.43万
依托单位：
Okinaka Memorial Institute for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16021258/
关键词：
肺発がんマウス耐性遺伝子トランスジェニックウレタン Poli

项目摘要

マウスPoli(DNA polymerase t)は18番染色体上に存在する肺発がん耐性遺伝子座Par2(Pulmonary adenoma resistance 2)の候補遺伝子である。Poliの過剰発現がウレタン誘発発がん感受性に及ぼす影響を調べるため、肺特異的発現プロモーターの下流にPoli cDNAを連結した外来遺伝子をマウス受精卵に注入し、Poliトランスジェニックマウスの作製を試みた。マウス肺腫瘍の殆どは肺胞2型上皮細胞より発生するものと考えられている。従って、肺胞2型上皮細胞で特異的に発現するヒトsurfactant protein C遺伝子のpromoterの下流にPromega社PCI vector由来のchimeric intron、C57BL/6マウス肺よりクローニングしたPoli cDNA、SV40 late polyA signalをこの順に連結した組換えPoli遺伝子を作製した。定法によって組換え、Poli遺伝子をBALB/cマウス受精卵にマイクロインジェクションした後、偽妊娠雌マウスの卵管へ移植し、仔マウスを出産させ、3匹の初代トランスジェニックマウスが創出された。その後、得られた初代トランスジェニックマウスをBALB/cマウスと交配し、transgeneを有する個体を継代した。各々のトランスジェニックマウス系統より2、3匹をサンプリングして屠殺し、肺組織を採取した。肺組織よりRNAを抽出した後、同RNAを使用した定量的RT-PCR行い、各トランスジェニックマウス系統におけるtransgeneの発現量を調べた。その際、endogenous Poli遺伝子由来のmRNAとtransgene由来のmRNAが区別できるよう、PCRプライマーの設定を工夫した。その結果、3系統のうちの1系統に微量の組換えPoli遺伝子mRNAの発現を検出したが、この量はendogenous Poli遺伝子発現量の10分の1以下であった。その他2系統では組換えPoli遺伝子の発現を認めなかった。微量の組換えPoli遺伝子発現を認めた系統のマウス10匹にウレタンを投与し、肺腫瘍の発生数を対照マウスと比較したが、統計学的に有意な差を検出できなかった。今年度の研究では、残念ながら組換えPoli遺伝子mRNAの十分な発現を示すトランスジェニックマウスを得ることができなかった。今後は、異なるプローモーターを採用して、さらにPoliトランスジェニックマウスの作出を試みると同時に、Poliノックアウトマウスの作出を行い、Poli発現が遺伝的肺発がん感受性に及ぼす影響を解明したい。

The mouse Poli (DNA polymerase t) is a candidate gene for the lung cancer resistance locus Par2 (Pulmonary adenoma resistance 2) that is present on chromosome 18. To investigate the effect of overexpression of Poli on urethane-induced carcinogenic susceptibility, we injected a foreign gene linked to Poli cDNA downstream of the lung-specific expression promoter into a fertilized mouse, and attempted to produce poli转基因小鼠。据认为，大多数小鼠肺肿瘤是由2型肺泡上皮细胞发展而来的。因此，制备了重组poli基因，其中Promega的PCI载体的嵌合内含子和C57BL/6小鼠肺克隆的poli cDNA和SV40 PolyA后期信号以该启动子的下游链接在人类表面活性剂蛋白C基因的下游序列上，该蛋白C基因的启动子（该启动子）特有表达为eLve acolor型细胞2上层2上层。使用常规方法重组后，将poli基因显微注射到受精的BALB/C小鼠卵中，将小鼠移植到假孕妇的雌性小鼠的输卵管中，并给出幼犬以产生三只主要转基因小鼠。然后用BALB/c小鼠育成获得的原发基因小鼠，并传递携带转基因的个体。从每个转基因小鼠菌株中取样两三只小鼠，处死，并收集肺组织。从肺组织中提取RNA后，使用相同的RNA进行定量RT-PCR，以检查每个转基因小鼠菌株中的转基因表达量。目前，我们设计了PCR引物的设置，以便可以区分源自转基因的内源性poli基因和mRNA的mRNA。结果，在三个菌株之一中检测到了痕量的重组poli基因mRNA，但该量小于内源性poli基因表达水平的十分之一。在其他两种菌株中未观察到重组poli基因的表达。在菌株中，十只小鼠施用了痕量的重组poli基因表达，并将肺部肿瘤发生的数量与对照小鼠进行了比较，但没有检测到统计学上的显着差异。不幸的是，今年的研究未能获得重组poli基因mRNA足够表达的转基因小鼠。将来，我们希望采用不同的启动子来进一步尝试产生poli poli转基因小鼠，同时还创建了poli敲除小鼠，以阐明poli表达对遗传性肺癌发生的影响。