免疫精製法を用いた転写ネットワークの解析

使用免疫纯化方法分析转录网络

基本信息

批准号：
14014230
负责人：
高橋直樹
金额：
$ 4.48万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14014230/
关键词：
転写調節標的遺伝子マイクロアレイクロマチンゲノム

项目摘要

我々は、MATα2などいくつかの酵母転写因子にエピトープタグを結合したコンストラクト約30を作製し、これらの転写因子が細胞内で直接結合している標的配列を抗体を用いて濃縮し、DNAマイクロアレイで全ゲノム中の結合配列を同定してきた(ChIP on Chip法)。最近Leeらによって、酵母の約100の転写因子の標的配列をChIP on Chip法で同定したという報告があった(Science298,799(2002))。我々が解析中の転写因子のいくつかは、その中に含まれていたが、結果が異なっていた。CRZ1,PH04などの転写因子については、我々は既知標的遺伝子の近傍の結合解列の濃縮を確認できたが、Leeらの報告では確認できていない。この相違の原因を明かにするため、培養条件、免疫精製法の条件の検討などを行なった。Leeらはすべての転写因子の解析は、酵母の培養を同一条件でおこなっているが、我々の結果と相違の見られた転写因子の多くは、外部からのシグナルによってリン酸化などの修飾を受け、転写調節活性が変化するものであり、培養の条件によって検出される標的配列が大きく変化するということを明かにした。また、タグの位置や種類、架橋の有無によっても結果に違いの生じる転写因子が存在することも明かになった。これらの成果をふまえて、MATα2,MCM1など既に解析した転写因子に加え、MATα1,STE12などの転写因子の解析を行ないつつあり、酵母mating typeの決定に関わる転写ネットワークの解明を目指している。

我们创建了大约 30 个构建体，其中表位标签附加到多种酵母转录因子（例如 MATα2）上，使用抗体富集细胞中这些转录因子直接结合的靶序列，并使用 DNA 微阵列对它们进行分析，我们已经在整个中鉴定了结合序列。基因组（ChIP on Chip 方法）。最近，Lee 等人报道，使用 ChIP on Chip 方法鉴定了大约 100 个酵母转录因子的靶序列（Science 298, 799 (2002)）。我们正在分析的一些转录因子也被包括在内，但结果不同。对于CRZ1和PH04等转录因子，我们能够确认已知靶基因附近未偶联序列的富集，但这在Lee等人的报告中并未得到证实。为了阐明这种差异的原因，我们研究了培养条件和免疫纯化条件。 Lee等人通过在相同条件下培养酵母来分析所有转录因子，但许多与我们的结果不一致的转录因子被磷酸化等外部信号所修饰，他们揭示了转录调节活性的变化，以及目标。检测到的序列根据培养条件的不同而有很大差异。研究还表明，有些转录因子的结果会根据标签的位置和类型以及交联的存在与否而有所不同。基于这些结果，除了已经分析的转录因子如MATα2和MCM1之外，我们目前正在分析转录因子如MATα1和STE12，目的是阐明参与确定酵母交配类型的转录网络。