ゲノム情報を利用した転写因子の標的遺伝子単離法の開発

利用基因组信息开发转录因子靶基因分离方法

基本信息

批准号：
12024217
负责人：
高橋直樹
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12024217/
关键词：
転写因子標的遺伝子ゲノム DNAアレイモデル生物

项目摘要

ゲノム情報を利用した標的遺伝子群の単離法の確立を目指し、全ゲノム配列の明らかになっている線虫および酵母をモデル生物として、実験法の検討を行った。標的配列の効率的な単離のため、これまで用いていた転写因子の特異的抗体による精製に代わって、タグ付き遺伝子導入個体を作製し、そのタグを利用した標的配列の単離が可能であるかどうか検討した。さらに全ゲノムレベルでの単離を行うためゲノムDNAアレイを用いた標的配列同定法の検討も行った。酵母ゲノムDNAアレイとしてaffymetrixの非翻訳領域を含むオリゴチップおよびORFチップを用いたが、両チップともHAタグを用いた精製DNAによってMATα2の標的遺伝子の特異的検出ができた。次に全ゲノム配列が明らかになっている多細胞生物である線虫で同様な解析を行うため以下の実験を行った。転写因子にタグを結合した遺伝子を導入したトランスジエニック個体において、導入遺伝子は線虫のミュータントフェノタイプをレスキューした。このことはタグ付き転写因子が正常蛋白と同様の標的遺伝子群の制御をしていることを示しており、タグを用いた標的配列の単離が可能であると考えられる。線虫は酵母と違い転写調節領域がかならずしもORF近傍(1kb内)に存在するするとは考えられないので、全ゲノムをスクリーニングするためには10万スポットのゲノムチップを作製する必要があるが、予備実験として1000スポットのゲノムチップを試作し、ゲノム中の標的配列を10倍以上濃縮できれば標的遺伝子を特定できることを確認した。

为了建立利用基因组信息分离目标基因组的方法，我们研究了使用已确定全基因组序列的线虫和酵母作为模式生物的实验方法。为了有效地分离目标序列，可以代替迄今为止使用的特定抗体来纯化转录因子，而是可以创建带标签的基因导入个体并使用标签来分离目标序列。是否有一个。此外，为了在全基因组水平上进行分离，我们还研究了使用基因组DNA阵列识别靶序列的方法。含有affymetrix非翻译区的寡芯片和ORF芯片被用作酵母基因组DNA阵列，并且这两种芯片都能够使用使用HA标签的纯化DNA特异性检测MATα2的靶基因。接下来，我们进行了以下实验，对秀丽隐杆线虫（一种全基因组序列已确定的多细胞生物）进行类似的分析。在用转录因子标记的基因转染的转基因个体中，转基因挽救了秀丽隐杆线虫的突变表型。这表明标记的转录因子以与正常蛋白质相同的方式调节靶基因组，并且认为可以使用标记来分离靶序列。与酵母不同，线虫不一定有位于 ORF 附近（1 kb 以内）的转录调控区，因此为了筛选整个基因组，需要创建具有 100,000 个斑点的基因组芯片作为实验。创建了具有1000个点的原型基因组芯片，并确认如果基因组中的目标序列可以富集10倍或更多，则可以识别目标基因。