DNAアレイを用いた転写因子の標的配列同定法の開発

开发使用 DNA 阵列识别转录因子靶序列的方法

基本信息

批准号：
12878131
负责人：
高橋直樹
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12878131/
关键词：
転写因子標的配列 DNAアレイオリゴスクレオチド

项目摘要

本研究は、転写因子の標的配列を明らかにする新しい方法を開発するというものである。転写因子の標的配列を同定する方法としては、ランダムな配列を含む合成オリゴヌクレオチドを、大腸菌発現系を用いて作製した蛋白を用い、抗体カラムやゲルシフトなどで精製をした後、ベクターにクローニングし、塩基配列を決定するという方法がある。しかしこの方法は、精製、クローニング、そして少なくとも数十の独立したクローンの塩基配列の決定と、かなり時間と手間がかかる方法である。本申請の方法は、DNAアレイとハイブリダイゼーションを用いるという方法であり、もしこの方法が確立すれば、きわめて短時間に多くの転写因子の標的配列を特定することができると考え以下の研究を行った。標的配列既知の酵母(MCM1,Matα2)、マウス(Hox)の転写因子に(His)6タグを結合した大腸菌発現コンストラクトを作製しタグ付き転写因子を調製した。MCM1,Matα2については、ランダムな配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物から標的配列を濃縮できることをPCR法によって確認した。またDNAアレイによる未知結合配列の検出が可能かどうかは、1000スポットのアレイを試作し、数十倍以上の濃縮があれば検出ができることを確認した。

本研究旨在开发一种揭示转录因子靶序列的新方法。为了鉴定转录因子的靶序列，一种方法是使用抗体柱或使用大肠杆菌表达系统产生的蛋白质进行凝胶转移来纯化含有随机序列的合成寡核苷酸，然后将其克隆到载体中进行确定。碱基序列。然而，这种方法相当耗时且费力，需要至少几十个独立克隆的纯化、克隆和测序。本申请提出的方法使用DNA阵列和杂交，如果该方法成立，将有可能在极短的时间内鉴定出许多转录因子的靶序列。我们进行了以下研究。创建大肠杆菌表达构建体，其中将 (His)6 标签附加到具有已知靶序列的酵母 (MCM1、Matα2) 和小鼠 (Hox) 转录因子，并制备带标签的转录因子。关于MCM1和Matα2，我们通过PCR证实目标序列可以从含有随机序列的寡核苷酸混合物中富集。此外，为了测试是否可以使用DNA阵列检测未知的结合序列，我们创建了具有1,000个点的原型阵列，并确认如果DNA阵列富集数十倍或更多，则可以进行检测。