DNAアレイを用いた転写因子の標的配列同定法の開発

开发使用 DNA 阵列识别转录因子靶序列的方法

基本信息

批准号：
12878131
负责人：
高橋直樹
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12878131/
关键词：
転写因子標的配列 DNAアレイオリゴスクレオチド

项目摘要

本研究は、転写因子の標的配列を明らかにする新しい方法を開発するというものである。転写因子の標的配列を同定する方法としては、ランダムな配列を含む合成オリゴヌクレオチドを、大腸菌発現系を用いて作製した蛋白を用い、抗体カラムやゲルシフトなどで精製をした後、ベクターにクローニングし、塩基配列を決定するという方法がある。しかしこの方法は、精製、クローニング、そして少なくとも数十の独立したクローンの塩基配列の決定と、かなり時間と手間がかかる方法である。本申請の方法は、DNAアレイとハイブリダイゼーションを用いるという方法であり、もしこの方法が確立すれば、きわめて短時間に多くの転写因子の標的配列を特定することができると考え以下の研究を行った。標的配列既知の酵母(MCM1,Matα2)、マウス(Hox)の転写因子に(His)6タグを結合した大腸菌発現コンストラクトを作製しタグ付き転写因子を調製した。MCM1,Matα2については、ランダムな配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物から標的配列を濃縮できることをPCR法によって確認した。またDNAアレイによる未知結合配列の検出が可能かどうかは、1000スポットのアレイを試作し、数十倍以上の濃縮があれば検出ができることを確認した。

这项研究旨在开发新方法来阐明转录因子的目标序列。识别转录因子的目标序列的一种方法是使用使用大肠杆菌表达系统制备的蛋白质，使用抗体柱或凝胶移位纯化，然后克隆到矢量中以确定基本序列。但是，这种方法非常耗时且费力，并具有纯化，克隆并确定至少数十个独立克隆的基础序列。该应用的方法是将杂交与DNA阵列一起使用，如果建立了这种方法，则认为可以在很短的时间内确定许多转录因子的目标序列，并进行以下研究。 A（His）6 TAG用于与具有已知靶序列的酵母（MCM1，MATα2）和小鼠（HOX）的转录因子结合，并制备了标记的转录因子。对于MCM1，MATα2，通过PCR证实，可以从含有随机序列的寡核苷酸的混合物中富集目标序列。此外，我们已经证实，可以通过1,000个斑点的原型阵列进行DNA阵列来检测未知的结合序列，并且如果浓度是多次或更多次，则可以执行该检测。