線虫転写因子群の系統的遺伝子破壊株を用いた網羅的ゲノム機能解析

使用线虫转录因子的系统基因破坏菌株进行全面的基因组功能分析

基本信息

批准号：
14011246
负责人：
三谷昌平
金额：
$ 4.48万
依托单位：
Tokyo Women's Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14011246/
关键词：
線虫転写因子遺伝子破壊ゲノム機能

项目摘要

線虫C.elegansは多細胞生物として最も早く全ゲノムシーケンスが解読され、ESTも整備されているモデル動物である。生活環が約3日と短く、形態、細胞系譜などの生物学的な基本的記載が充実している。線虫を材料に、バイオインフォマティックスを併用した遺伝学的な解析を行うことで発生の分子メカニズムを解明することは、生物学的な理解において極めて有効なアプローチの1つと言える。ゲノムシーケンスに基づく逆遺伝学的なアプローチによるシステマティックな転写因子の変異体の分離を行いつつ、一方で、トランスジェニック解析によりそれらの遺伝子の発現制御と機能を解明することを目的としている。トランスジェニック法による発現・機能解析を効率良く行うために、PCRベースによるプロモーター/エンハンサを簡便かつ確実にサブクローンできる実験系が必要である。これを達成するために、ECFP、EGFP、EYFP、DsRedExpress1を導入したTAクローニング・ベクター・システムを開発した。これらにより、迅速に多数の発現解析を行うことが可能になり、3重染色が容易に可能であることが明らかになった。さらに、PCR SOEing法を用いることにより、イントロン内に存在するエンハンサ配列を含みながら、その遺伝子の機能的蛋白質を発現しないで、より正確に発現制御を行うことができるシスエレメントを蛍光蛋白質の上流にサブクローンすることが可能になった。また、発現解析ができたコンストラクトを元に、蛍光蛋白質を異なる遺伝子のcDNAに置き換えることにより、機能解析にも使用できることが明らかになった。

线虫秀丽隐杆线虫是多细胞生物中最早破译全基因组序列并制备出EST的模式动物。它的生命周期较短，约为3天，形态和细胞谱系等基本生物学信息已得到充分记录。以秀丽隐杆线虫为材料，通过遗传分析结合生物信息学来阐明发育的分子机制，可以说是理解生物学最有效的方法之一。在使用基于基因组测序的反向遗传方法系统分离转录因子变异体的同时，我们还旨在通过转基因分析阐明这些基因的表达调控和功能。为了使用转基因方法有效地进行表达和功能分析，需要一个能够使用 PCR 轻松可靠地亚克隆启动子/增强子的实验系统。为了实现这一目标，我们开发了引入 ECFP、EGFP、EYFP 和 DsRedExpress1 的 TA 克隆载体系统。这些方法使得快速进行多重表达分析成为可能，并表明三重染色是很容易实现的。此外，通过使用PCR SOEing方法，我们可以在荧光蛋白的上游放置一个顺式元件，这样可以在不表达基因功能蛋白的情况下进行更精确的表达控制，同时包含内含子中存在的增强子序列。进行亚克隆。还表明，通过用不同基因的cDNA替换荧光蛋白，用于表达分析的构建体可以用于功能分析。