トウモロコシ性決定遺伝子Silklessクローニングの試み

玉米性别决定基因的无丝克隆尝试

基本信息

批准号：
09262207
负责人：
吉岡泰
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09262207/
关键词：
プログラム細胞死トウモロコシ性分化

项目摘要

これまでに、約100万個の独立したクローンからなるear cDNAライブラリーをスクリーニングし、TS2タンパク質のカルボキシル末端側半分の領域と相互作用するポジティブクローン6個を得た。これらは未知のタンパク質をコードする物2個、シャペロニンであるDnaJの植物におけるホモログをコードする物3個、及び酵母の細胞増殖に関与するprolifera proteinと高い相同性を示す物の1つに分類された。TS2タンパク質のアミノ末端側半分の領域と相互作用するタンパク質のスクリーニングも行ったが、false positive クローンが大量に得られた。現在、TS2のアミノ末端側の様々な領域を欠失させたスクリーニング用のプラスミドを用い、アミノ末端側のどの部分がfalse positiveを生じる原因となっているのか解析している。発現量の低いcDNAを得るには合計して200万のの独立したcDNAクローンをスクリーニングする必要がある。そこで、さらに、100万の独立したクローンからなるcDNAを作製した。今後このcDNAライブラリーもスクリーニングする予定である。また、得られたポジティブクローンはcDNAの一部分しか持っていないので、ラムダファージベクターを用いて作製した。era cDNAライブラリーをスクリーニングし、cDNAの全長を明らかにする予定である。その後、cDNAがコードするタンパク質を大腸菌内で合成させて精製し、免疫沈降法などの方法により実際にそのタンパク質がTS2タンパク質と相互作用するか確認する。また、それらのcDNAをトウモロコシの染色体上にマップし、SK1遺伝視座近傍に位置する物がないか調べる計画である。

到目前为止，我们已经筛选了一个带有约100万个独立克隆的耳cDNA文库，并获得了六个与TS2蛋白碳氧基端相互作用的阳性克隆。这些编码为两个未知蛋白的代码，即DNAJ植物中的三个同源物，它们是伴侣蛋白，涉及酵母细胞增殖的蛋白质，以及一种高同源物质。进行了与TS2蛋白的氨基端端的一半端面积相互作用的蛋白质的筛选，但获得了大量的假阳性克隆。当前，使用筛选质粒在TS2氨基端端失去各个区域的质粒正在分析氨基端端的哪一部分会导致假阳性。为了获得低表达的cDNA，有必要总共筛选200万个独立的cDNA克隆。因此，创建了由100万个独立克隆制成的cDNA。将来将筛选此cDNA库。另外，由于获得的阳性克隆仅具有cDNA的一部分，因此它是使用lambda滤波器载体制成的。将筛选ERA cDNA库以揭示cDNA的总长度。此后，由cDNA编码的蛋白质在大肠杆菌中合成并进行纯化，并且该蛋白实际上通过一种免疫沉淀方法等方法与TS2蛋白相互关联。该计划是在玉米的染色体上绘制这些cDNA，并检查SK1遗传观点附近是否有任何位置。