In vitro受精法を用いた胚発生第一分裂における極性決定の分子機構

体外受精胚胎发育第一次分裂极性决定的分子机制

基本信息

批准号：
15031222
负责人：
小柴共一
金额：
$ 3.84万
依托单位：
Tokyo Metropolitan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

トウモロコシの卵細胞、in vitro受精法で作製した2細胞胚、その胚から単離した頂端細胞および基部細胞からcDNAを合成し、これら4種のcDNAをテンプレートとしてRAPD-PCRを行った。その結果、受精後に新たに発現する遺伝子もしくは発現が抑制される遺伝子が同定され、それらの発現パターンから1)頂端細胞においてのみ発現する遺伝子、2)基部細胞においてのみ発現する遺伝子、3)頂端および基部細胞の双方の細胞で発現する遺伝子、4)頂端細胞においてのみ発現が抑制されている遺伝子、5)基部細胞においてのみ発現が抑制されている遺伝子、6)恒常的に発現している遺伝子、の6つのグループに分類した。さらに、受精により発現が誘導される遺伝子の発現を受精卵から2細胞胚までの受精卵発達過程で調べたところ、胚発生の第一細胞分裂以前に受精卵細胞中においてそれら遺伝子が既に発現していることが明らかになった。このことから、グループ1または2の遺伝子転写産物が受精卵中の頂端または基部領域に局在していることを示唆された。トウモロコシ卵細胞タンパク質をSDS-または2D-PAGEで展開後、ゲル中の主要タンパク質バンド/スポットをLC-MS/MSにより解析した。その結果、卵細胞主要タンパク質として、3種の解糖系酵素、2種のミトコンドリアタンパク質およびアネキシンp35を同定した。未開花のイネ花より卵細胞と精細胞をおのおの単離する系を確立し、イネin vitro受精系の確立に向けて研究を進めている。また、16個のイネ卵細胞からのcDNA合成に成功した。受精卵や2細胞胚など極微量試料からのRNAを出発材料にしてマイクロアレイ解析を行う予定であるが、このような微量のRNAをアレイ解析用のプローブ作製に用いた際のデータの信頼性を検証する研究も進行させている。

从玉米卵细胞、体外受精制备的二细胞胚胎以及从胚胎中分离的顶细胞和基底细胞合成cDNA，并使用这四种cDNA作为模板进行RAPD-PCR。结果，鉴定了受精后新表达或表达被抑制的基因，并且基于其表达模式，1)仅在顶端细胞中表达的基因，2)仅在基底细胞中表达的基因，以及3)仅在基底细胞中表达的基因在顶细胞和基底细胞中均表达的基因，4）仅在顶细胞中表达被抑制的基因，5）仅在基底细胞中表达被抑制的基因，6）持续表达的基因，分为六种。组。此外，我们还研究了受精卵从受精卵到二细胞胚胎的发育过程中受精诱导表达的基因的表达情况，发现这些基因在第一个细胞之前就已经在受精卵细胞中表达。很明显，胚胎发育的分裂是存在的。这表明第 1 组或第 2 组基因转录本位于受精卵的顶端或基底区域。通过 SDS 或 2D-PAGE 开发玉米卵细胞蛋白后，通过 LC-MS/MS 分析凝胶中的主要蛋白条带/斑点。结果，三种类型的糖酵解酶、两种类型的线粒体蛋白和膜联蛋白 p35 被确定为主要的卵细胞蛋白。我们已经建立了从未开花的稻花中分离卵细胞和精子细胞的系统，并且正在进行建立水稻体外受精系统的研究。我们还成功地从16个水稻卵细胞中合成了cDNA。我们计划使用来自极少量样品（例如受精卵和2细胞胚胎）的RNA作为起始材料进行微阵列分析，但我们目前正在研究当使用如此少量的RNA来创建阵列探针时数据的可靠性分析也正在进行中以验证这一点。