Wntリガンドの動態計測に基づく組織発生機構の解析

基于Wnt配体动力学测量的组织发育机制分析

基本信息

批准号：
21H02498
负责人：
高田慎治
金额：
$ 11.15万
依托单位：
National Institutes of Natural Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H02498/
关键词：
遺伝子細胞発生・分化シグナル伝達発生

项目摘要

本研究では、分泌シグナルの拡散状態の違いに注目し、それを生み出す分子機構とその生物的意義を検討することを研究の中心に据え、以下の３つの問いを設定している。(1) 複数の複合体構造や異なる拡散性を取りうるという特徴は、Wntの種類や発現細胞の違いに関わらず共通にみられることか、それとも多様性があるのか。(2)拡散性が異なる状態への移行はどのように制御されるのか。(3)低拡散状態と高拡散状態の各々が持つ生物学的意義とは何か。これらの問いに対して、今年度に得られた主たる成果は以下のとおりである。(1) 内在のWntが実際に複合体を形成するのかを検討するために、Wnt3aが発現することが知られている胎生７日相当のエピブラストを誘導する培養系の確立を試みた。しかしながら、誘導効率が十分ではなく、目的とする細胞を効率よく誘導するための条件検討を引き続き行う予定である。 (2) ゲノム編集により樹立した内在のWntに蛍光蛋白を付加さたノックインフィッシュを用いて、内在性Wntの観察・測定を引き続き行った。その結果、蛍光付きタンパク質は比較的高い拡散能を有していることが蛍光相関分光解析より明らかになったが、その一方で実際にWntが付加した蛍光タンパク質の拡散が本当に高いのかどうかについてはより慎重な解析が必要であるとの結論に達した。(3) 前年度までの解析により、WntおよびsFRPの種類により相互の結合性が異なることが示されたことから、その特異性の意義を培養細胞系とアフリカツメガエルの初期胚を用いて解析した。その結果、WntとsFRPが複合体形成することと、細胞膜表面への親和性の間には相関関係があり、sFRPと複合体を形成することによってWntは細胞膜上の特定タンパク質(HSPG)と結合するものと考えられた。さらに、HSPGと Wnt3aとの結合性を免疫沈降法により確認した。

在本研究中，我们关注分泌信号扩散状态的差异，并重点考察其产生的分子机制及其生物学意义，并提出以下三个问题。（1）无论Wnt的类型或表达的细胞如何，多重复杂结构和不同扩散性的特征对于Wnt来说是共同的，还是具有多样性的？ (2) 如何控制向不同扩散率状态的转变？（3）低扩散态和高扩散态的生物学意义是什么？今年针对这些问题取得的主要成果如下。 (1) 为了检查内源性 Wnt 是否确实形成复合体，我们尝试建立一个培养系统，诱导相当于胚胎生命第 7 天的外胚层，已知 Wnt3a 在此表达。然而，诱导效率还不够，我们计划继续研究有效诱导靶细胞的条件。 (2)我们继续使用基因敲入鱼来观察和测量内源性Wnt，其中荧光蛋白添加到通过基因组编辑建立的内源性Wnt中。结果，荧光相关光谱显示荧光蛋白具有相对较高的扩散能力，但另一方面，尚不清楚带有Wnt的荧光蛋白的扩散是否真的很高，我们得出的结论是需要更仔细的分析。 (3)截至前一年的分析表明，根据Wnt和sFRP的类型，相互结合特性有所不同，因此我们使用培养细胞系统和早期非洲爪蟾胚胎分析了它们特异性的意义。结果，Wnt和sFRP之间的复合物的形成与它们对细胞膜表面的亲和力之间存在相关性，并且通过与sFRP形成复合物，Wnt与细胞膜上的特定蛋白质(HSPG)结合。人们认为会的。此外，通过免疫沉淀证实了HSPG和Wnt3a之间的结合。