リゾチームの塩酸グアニジン変性構造の解析

溶菌酶盐酸胍修饰结构分析

基本信息

批准号：
08272207
负责人：
藤原敏道
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Yokohama National University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

蛋白質の構築原理を理解するためには変性状態のタンパク質の構造を知り、天然構造との違いを物理化学的に明らかにする必要がある。よく研究されている卵白リゾチームについては、6M塩酸グアニジン存在下、pH2.5、10CではNMRから完全変性状態にあると考えられる。ところが、そのNMRスペクトルには半減期5時間以上のアミドプロトンが観測され、高次構造が存在していることを示唆した。そこで本研究では、この卵白リゾチームに関し、各アミノ酸残基についてHD交換速度を測定した。このために、リゾチームを塩酸グアニジンである時間変性させ、その後急激に希釈して天然状態に戻してから、分解能のよい2次元NOESYのNMRスペクトルを測定した。このスペクトルのH^αとNHのクロスピークの時間に依存した減衰をプロットし、これより交換速度を求めた。これから、α-ヘリックスやβ-シートなどの2次構造の部分、特にヘリックスCの部分が遅くプロテクション・ファクターは5から遅いもので100程度であった。60から65番目はループ部位に関わらず極めて交換速度の遅いNHが存在した。交換の遅い部分は、今まで尿素変性や温度変性で報告されている部分と一致しているが、塩酸グアニジン変性では10倍ほどプロテクション・ファクターが大きくなっている。塩酸グアニジン変性状態では、それら遅い残基NH近傍に水分子が接近できないようなコンパクトな構造を取っていると考えられる。

为了理解蛋白质的构建原理，有必要了解变性状态下蛋白质的结构，并从物理化学角度阐明其与天然结构的差异。经过充分研究，基于 NMR，在 pH 2.5、10℃、6M 盐酸胍存在下，蛋清溶菌酶被认为处于完全变性状态。然而，在NMR谱中观察到半衰期超过5小时的酰胺质子，表明存在高阶结构。因此，在本研究中，我们测量了蛋清溶菌酶中每个氨基酸残基的HD交换率。为此，我们用盐酸胍将溶菌酶变性一段时间，然后将其快速稀释回自然状态，然后测量了分辨率良好的二维NOESY NMR谱。绘制了该光谱中 H^α 和 NH 交叉峰随时间的衰减，并由此确定交换率。由此可见，α-螺旋、β-折叠等二级结构，特别是螺旋C部分，其保护因子较慢，为5～100。从第60位到第65位，无论环路位置如何，都存在交换速率极慢的NH。慢速交换区域与之前报道的尿素变性和温度变性的区域一致，但盐酸胍变性的保护因子大约大10倍。在盐酸胍的变性状态下，人们认为其具有致密的结构，其中水分子无法接近这些缓慢残基NH的附近。