F_0F_1-ATP合成酵素サブユニットcの固体NMR法による構造決定

固态NMR法测定F_0F_1-ATP合酶c亚基结构

基本信息

批准号：
13033012
负责人：
藤原敏道
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

固体NMR測定のために安定同位体を用いたF_0F_1-ATP合成酵素サブユニットcの調製し脂質膜に再構成する法を確立し,固体2次元NMR実験を行った。^<13>C,^<15>N完全標識には,大腸菌の大量発現系を用いた.精製は,有機溶媒を用いる方法で効率よく精製できることがわかった.再構成のためには、界面活性剤を加えて可溶化した後に、透析して膜に埋め込む方法が有効であることがわかった。完全標識したサブユニットcの^<13>C-^<13>C等方化学シフト相関スペクトルおよび^<15>N-^<13>C相関スペクトルを測定した。得られたスペクトルから、等方化学シフトを解析することにより、二次構造としてはαヘリックスが主であること、これ以外に、10分の1弱程度の残基が分子鎖が伸びた状態であることがわかった。これは、溶液NMRから提出されている構造とほぼ一致するものである。このように多次元NMRスペクトルに基ずく等方化学シフトの解析が構造解析に有効であることがわかった。現在さらに定量的な解析を行うために、原子座標から固体多次元NMRスペクトルをシュミレーションする方法を開発している。^<13>C選択的標識サブユニットcについては、分子間の距離を測定するために、標識サブユニットcを天然存在比のサブユニットcで希釈した試料を作り、固体NMRの回転共鳴実験を行った。これにより4次構造に関する情報を得ることが期待できた。まだ固体NMRスペクトルから2次構造の解析を行っている段階で、サブユニットcの構造決定に至っていないが、測定条件と測定法、解析法の確立により,これからの固体NMRによる3次および4次構造決定のための基礎ができた.

建立了一种方法来准备使用稳定的同位素进行固态NMR测量并将其重构为脂质膜，并进行固态2D NMR实验。大肠杆菌的大规模表达系统用于 ^<13> c， ^<15> n的完整标记。已经发现，使用有机溶剂可以有效地纯化纯化。对于重构，发现一种通过添加表面活性剂，然后透析和嵌入膜中溶解的方法是有效的。测量了 ^<13> c - ^<13> C的各向同性化学移位相关光谱和 ^<15> n - ^<13> C相关光谱的 ^<15> n - ^<13> C相关光谱。从获得的光谱中，对各向同性化学位移的分析表明，二级结构主要是α-螺旋，除此之外，分子链还以约十分之一的残基扩展。这大致与解决方案NMR提交的结构一致。因此，发现基于多维NMR光谱的各向同性化学位移的分析对于结构分析有效。当前，正在开发一种方法来模拟来自原子坐标的固体多维NMR光谱以进行进一步的定量分析。对于 ^<13> C选择性标记的亚基C，准备了一个样品，在该样品中，用自然丰度比的亚基C稀释标记的亚基C，以测量分子之间的距离，并使用固体NMR进行旋转谐振实验。这可以预期提供有关二次结构的信息。尽管在分析固态NMR光谱的二级结构的阶段尚未确定亚基C的结构，但测量方法的建立，测量方法和分析方法为将来确定使用固态NMR的元试验和Quaternary结构的确定创造了基础。