F_0F_1-ATP合成酵素サブユニットcの固体NMR法による構造決定

固态NMR法测定F_0F_1-ATP合酶c亚基结构

基本信息

批准号：
13033012
负责人：
藤原敏道
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

固体NMR測定のために安定同位体を用いたF_0F_1-ATP合成酵素サブユニットcの調製し脂質膜に再構成する法を確立し,固体2次元NMR実験を行った。^<13>C,^<15>N完全標識には,大腸菌の大量発現系を用いた.精製は,有機溶媒を用いる方法で効率よく精製できることがわかった.再構成のためには、界面活性剤を加えて可溶化した後に、透析して膜に埋め込む方法が有効であることがわかった。完全標識したサブユニットcの^<13>C-^<13>C等方化学シフト相関スペクトルおよび^<15>N-^<13>C相関スペクトルを測定した。得られたスペクトルから、等方化学シフトを解析することにより、二次構造としてはαヘリックスが主であること、これ以外に、10分の1弱程度の残基が分子鎖が伸びた状態であることがわかった。これは、溶液NMRから提出されている構造とほぼ一致するものである。このように多次元NMRスペクトルに基ずく等方化学シフトの解析が構造解析に有効であることがわかった。現在さらに定量的な解析を行うために、原子座標から固体多次元NMRスペクトルをシュミレーションする方法を開発している。^<13>C選択的標識サブユニットcについては、分子間の距離を測定するために、標識サブユニットcを天然存在比のサブユニットcで希釈した試料を作り、固体NMRの回転共鳴実験を行った。これにより4次構造に関する情報を得ることが期待できた。まだ固体NMRスペクトルから2次構造の解析を行っている段階で、サブユニットcの構造決定に至っていないが、測定条件と測定法、解析法の確立により,これからの固体NMRによる3次および4次構造決定のための基礎ができた.

对于固态NMR测量，我们建立了使用稳定同位素制备F_0F_1-ATP合酶c亚基并将其重构为脂质膜的方法，并进行了固态二维NMR实验。为了完全标记^ 13 C，^ 15 N，我们在大肠杆菌中使用了大规模表达系统。发现使用有机溶剂的方法可以有效地进行纯化。为了重构，界面已发现添加活性剂使其溶解、然后透析并将其包埋在膜中的方法是有效的。测量完全标记的亚基c的^ 13 C-^ 13 C各向同性化学位移相关光谱和^ 15 N-^ 13 C相关光谱。通过对获得的光谱进行各向同性化学位移分析，我们发现二级结构主要是α-螺旋，此外，大约十分之一的残基具有延长的分子链。这几乎与溶液 NMR 提交的结构相符。这样，发现基于多维NMR谱的各向同性化学位移分析对于结构分析是有效的。目前，我们正在开发一种从原子坐标模拟固态多维核磁共振谱的方法，以便进行更多的定量分析。 ^ 13C 关于选择性标记的亚基c，为了测量分子间的距离，通过用亚基c的天然丰度稀释标记的亚基c来制备样品，并进行固态NMR旋转共振实验去了。希望这将提供有关四级结构的信息。虽然亚基c的结构尚未确定，我们仍在从固态NMR谱分析二级结构，但测量条件、测量方法和分析方法的建立将使我们能够通过固态预测三级和四级结构。 -态NMR。确定结构的基础已经建立。