Multi-scale structural analysis of membrane protein in cells by hyperpolarized NMR

利用超极化核磁共振对细胞膜蛋白进行多尺度结构分析

基本信息

批准号：
21K06046
负责人：
藤原敏道
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

相互作用する膜蛋白質に重点を置き細胞を対象にしてマルチスケールにわたる構造解析を行う方法の開発とその応用実証を行った。この課題で重要なのは，最先端のNMR測定法とその応用に最適な細胞試料調製法を組み合わせて解析を行うことである。NMRの低感度に対しては，温度20Kの高磁場動的核分極法（DNP）を用いて超偏極核スピン状態を作り出し，マジック角試料回転により高分解能NMR感度を5000倍向上させた。このための超偏極クライオNMR装置開発では，冷却Heガス循環法によって実用的で長時間安定して低温によりノイズも削減してNMR感度向上を実現した。これを応用して，感度の低い蛋白質・糖，蛋白質・脂質などについても分子間相互作用をNMR交差信号として検出できるようにした。従来のin-cell NMR法では，分子量5万以上の蛋白質検出が困難という制約を受けるが分解能で優れる溶液NMRが用いられていた。今回は，その分子量に関する選択性に影響されずに，全ての分子を定量的に測定できる固体NMR法を用いた。これを利用して細胞数計測と組み合わせて1細胞当たりの分子状態を反映した存在量を計測する。これで，運動性の低い膜蛋白質や重合体の構造解析を可能にした。細胞内の位置測定のために，イメージング法MRIで用いる常磁性造影剤とDNP用分極剤を用いて，細胞内の位置情報をNMR信号強度にエンコードした。このために造影剤Gd3+錯体が局在することで大腸菌表面を内部特別して選択的にNMR測定できることを示した。常磁性緩和促進と1Hスピン拡散により膜蛋白質と膜から離れて細胞内にある蛋白質を区別できることを示した。この解析には，相補的な構造情報を得られる電子顕微鏡細胞観察とも組み合わせた。

我们开发了一种细胞多尺度结构分析的方法，重点是相互作用的膜蛋白，并证明了其应用。在这个问题中，重要的是通过将尖端NMR测量方法与细胞样品制备方法相结合，对其应用进行分析。对于NMR的低灵敏度，在20K的温度下，使用高场动态核极化（DNP）创建了超极化的核自旋态，并通过旋转魔术角样品来提高高分辨率NMR灵敏度的5000倍。因此，在开发超极化的冷冻-NMR设备时，使用冷却HE气体循环方法已用于实现实用，长时间稳定，并且通过低温降低噪声，从而提高了NMR敏感性。通过应用此方法，可以将分子间相互作用视为蛋白质，糖，蛋白质，脂质等的NMR交叉信号，具有低灵敏度。常规的内部NMR方法已限于难以检测分子量为50,000或更多的蛋白质，但是使用了具有出色分辨率的溶液NMR。在本文中，我们使用了一种固态NMR方法，该方法允许对所有分子进行定量测量，而不会受到其分子量选择性的影响。这用于测量通过将其与细胞计数测量结合的每个细胞分子状态的丰度。这使得可以用低运动膜蛋白和聚合物在结构上进行分析。对于细胞内位置的测量，使用顺磁对比剂和用于成像MRI的DNP的极化器将细胞内位置信息编码为NMR信号强度。因此，结果表明，对比剂GD3+复合物的定位允许在内部特别在内部进行大肠杆菌表面的选择性NMR测量。已经表明，顺磁性松弛促进和1H自旋扩散可以区分膜蛋白和细胞内蛋白，而不是膜。该分析与电子显微镜细胞观察结合，从而提供互补的结构信息。

项目成果

期刊论文数量（11）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

A hybrid strategy combining solution NMR spectroscopy and isothermal titration calorimetry to characterize protein-nanodisc interaction

结合溶液核磁共振波谱和等温滴定量热法来表征蛋白质-纳米盘相互作用的混合策略

DOI：
10.1016/j.ab.2021.114521
发表时间：
2022
期刊：
Analytical Biochemistry
影响因子：
2.9
作者：
Sugiki Toshihiko;Lee Young-Ho;Alsanousi Nesreen;Murata Kaito;Kawamura Izuru;Fujiwara Toshimichi;Hanada Kentaro;Kojima Chojiro
通讯作者：
Kojima Chojiro

機能構造計測学研究室

功能结构计量实验室

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

Cryogenic signal amplification combined with helium-temperature MAS DNP toward ultimate NMR sensitivity at high field conditions

低温信号放大与氦温 MAS DNP 相结合，可在高场条件下实现终极 NMR 灵敏度

DOI：
10.1016/j.jmr.2021.107139
发表时间：
2022
期刊：
Journal of Magnetic Resonance
影响因子：
2.2
作者：
Matsuki Yoh;Nakamura Shinji;Hobo Fumio;Endo Yuki;Takahashi Hiroki;Suematsu Hiroto;Fujiwara Toshimichi
通讯作者：
Fujiwara Toshimichi

Dynamics of the HP1 Hinge Region with DNA Measured by Site-Directed Spin Labeling-EPR Spectroscopy