Multi-scale structural analysis of membrane protein in cells by hyperpolarized NMR

利用超极化核磁共振对细胞膜蛋白进行多尺度结构分析

基本信息

批准号：
21K06046
负责人：
藤原敏道
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

相互作用する膜蛋白質に重点を置き細胞を対象にしてマルチスケールにわたる構造解析を行う方法の開発とその応用実証を行った。この課題で重要なのは，最先端のNMR測定法とその応用に最適な細胞試料調製法を組み合わせて解析を行うことである。NMRの低感度に対しては，温度20Kの高磁場動的核分極法（DNP）を用いて超偏極核スピン状態を作り出し，マジック角試料回転により高分解能NMR感度を5000倍向上させた。このための超偏極クライオNMR装置開発では，冷却Heガス循環法によって実用的で長時間安定して低温によりノイズも削減してNMR感度向上を実現した。これを応用して，感度の低い蛋白質・糖，蛋白質・脂質などについても分子間相互作用をNMR交差信号として検出できるようにした。従来のin-cell NMR法では，分子量5万以上の蛋白質検出が困難という制約を受けるが分解能で優れる溶液NMRが用いられていた。今回は，その分子量に関する選択性に影響されずに，全ての分子を定量的に測定できる固体NMR法を用いた。これを利用して細胞数計測と組み合わせて1細胞当たりの分子状態を反映した存在量を計測する。これで，運動性の低い膜蛋白質や重合体の構造解析を可能にした。細胞内の位置測定のために，イメージング法MRIで用いる常磁性造影剤とDNP用分極剤を用いて，細胞内の位置情報をNMR信号強度にエンコードした。このために造影剤Gd3+錯体が局在することで大腸菌表面を内部特別して選択的にNMR測定できることを示した。常磁性緩和促進と1Hスピン拡散により膜蛋白質と膜から離れて細胞内にある蛋白質を区別できることを示した。この解析には，相補的な構造情報を得られる電子顕微鏡細胞観察とも組み合わせた。

我们开发了一种细胞多尺度结构分析的方法，重点关注相互作用的膜蛋白，并展示了其应用。这项任务的关键是将尖端 NMR 测量方法与最适合其应用的细胞样品制备方法相结合来进行分析。针对核磁共振灵敏度低的问题，我们采用20 K温度下的高场动态核极化（DNP）来创建超极化核自旋态，并利用魔角样品旋转将高分辨率核磁共振灵敏度提高了5000倍。为此目的开发超极化冷冻核磁共振装置时，我们利用冷却氦气循环方法实现了实用且长期的稳定性，降低了低温产生的噪音，并提高了核磁共振灵敏度。通过应用这一技术，即使对于灵敏度较低的蛋白质、糖、蛋白质和脂质，我们也可以将分子间相互作用作为 NMR 交叉信号进行检测。传统的细胞内核磁共振方法因难以检测分子量为 50,000 或以上的蛋白质而受到限制，但已使用具有出色分辨率的溶液核磁共振。这次，我们使用了固态NMR方法，可以定量测量所有分子，而不受分子量选择性的影响。利用这一点并将其与细胞计数相结合，我们可以测量反映每个细胞分子状态的丰度。这使得分析膜蛋白和低迁移率聚合物的结构成为可能。为了测量细胞内位置，我们使用顺磁造影剂和 MRI 成像方法中使用的 DNP 偏振剂将细胞内位置信息编码为 NMR 信号强度。为此，我们表明，通过定位造影剂 Gd3+ 复合物，我们可以选择性地在大肠杆菌表面内部进行 NMR 测量。我们表明，可以通过顺磁弛豫增强和 1H 自旋扩散来区分膜蛋白和远离膜且位于细胞内部的蛋白质。该分析与电子显微镜细胞观察相结合，提供了补充的结构信息。

项目成果

期刊论文数量（11）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

A hybrid strategy combining solution NMR spectroscopy and isothermal titration calorimetry to characterize protein-nanodisc interaction

结合溶液核磁共振波谱和等温滴定量热法来表征蛋白质-纳米盘相互作用的混合策略

DOI：
10.1016/j.ab.2021.114521
发表时间：
2022
期刊：
Analytical Biochemistry
影响因子：
2.9
作者：
Sugiki Toshihiko;Lee Young-Ho;Alsanousi Nesreen;Murata Kaito;Kawamura Izuru;Fujiwara Toshimichi;Hanada Kentaro;Kojima Chojiro
通讯作者：
Kojima Chojiro

機能構造計測学研究室

功能结构计量实验室

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

Dynamics of the HP1 Hinge Region with DNA Measured by Site-Directed Spin Labeling-EPR Spectroscopy

DOI：
10.1007/s00723-022-01519-2
发表时间：
2023-01-05
期刊：
APPLIED MAGNETIC RESONANCE
影响因子：
1
作者：
Suetake，Isao;Sato，Kazunobu;Arata，Toshiaki
通讯作者：
Arata，Toshiaki

Cryogenic signal amplification combined with helium-temperature MAS DNP toward ultimate NMR sensitivity at high field conditions

低温信号放大与氦温 MAS DNP 相结合，可在高场条件下实现终极 NMR 灵敏度

DOI：
10.1016/j.jmr.2021.107139
发表时间：
2022
期刊：
Journal of Magnetic Resonance
影响因子：
2.2
作者：
Matsuki Yoh;Nakamura Shinji;Hobo Fumio;Endo Yuki;Takahashi Hiroki;Suematsu Hiroto;Fujiwara Toshimichi
通讯作者：
Fujiwara Toshimichi

High-field DNP-induced spin correlated states for magic-angle-spinning solid-state NMR experiments

用于魔角旋转固态核磁共振实验的高场 DNP 诱导自旋相关态