F_0F_1-ATP合成酵素サブユニットcの固体NMR法による構造解析

固态NMR法分析F_0F_1-ATP合酶c亚基的结构

基本信息

批准号：
11169214
负责人：
藤原敏道
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Osaka University (2000)Yokohama National University (1999)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

固体NMR測定のために安定同位体を用いたF_0F_1-ATP合成酵素サブユニットcの調製法を確立し,固体NMR実験を行った。アミノ酸配列特異的に同位体標識を行える有機化学的な方法では,最初に79残基の全配列を固相法で一度に合成しする.cサブユニットの精製は,主に逆相HPLCを用いて行う.この方法の収率は5%程度であったので,比較的安価に固体NMR試料を作れるようになった.今年度はこの方法で,異なる分子鎖上にあるAla24C^βとAla64C^αのみを^<13>C標識したサブユニットcを有機合成した.この試料について核間距離を測定するため,サブユニットcを生体膜に再構成して,NMR線幅が0.5ppm程度になり分解能が最も高くなる測定条件を求めた.^<13>C,^<15>N完全標識には,大腸菌の大量発現系を用いた.精製は,有機溶媒を用いる方法で効率よく精製できることがわかり,現在大量培養を行っている.これら試料を用いることにより,固体NMR法で全構造の解析ができると考えられる.このことを明らかにするために,溶液NMRで決めた化学シフトに基づいて正確にシミュレートした3次元固体NMRスペクトルについて,各残基の信号を分離して帰属できるかどうかを調べた.その結果,隣接するC^α炭素間などについての3次元等方化学シフト相関スペクトルを測定することにより,信号幅が1ppm程度ならば,ほぼすべての信号帰属が可能なことがわかった.また,今年度はこれ以外に,多次元相関スペクトルを用いて実際のペプチドの^<13>Cと^<15>N信号の帰属が可能なことを,15残基のペプチドであるマストパランXに応用して,二次構造を求められることを確かめた.まだサブユニットcの構造決定に至っていないが測定条件と測定法の確立により,これからの固体NMRによる構造決定のための基礎ができた.

建立了一种使用稳定同位素制备F_0F_1-ATP合酶亚基C进行固态NMR测量的方法，并进行了固态NMR实验。在有机化学方法中，该方法允许在氨基酸序列中专门进行同位素标记，首先使用固相法立即合成79个残基的整个序列。 C亚基主要使用反向相位的HPLC纯化。该方法的产量约为5％，使得使固体NMR样品相对便宜成为可能。今年，该方法用于在不同的分子链上使用ALA24C^β和Ala64c^α创建亚基，并使用此方法使用此方法使用相同的方法使用^<13> c标记的亚基使用^<13> c标记的亚基创建亚基。 C有机合成。为了测量该样品的核能距离，将亚基C重构为生物膜，并确定测量条件，其中NMR线宽度约为0.5 ppm，并且分辨率最高。对于 ^<13> C， ^<15> N的完整标记，使用了大肠杆菌的大规模表达系统。发现纯化通过使用有机溶剂有效，目前正在进行大量培养物。通过使用这些样品，可以实现固体NMR。人们认为，可以使用该方法来实现所有结构的分析。为了澄清这一点，我们研究了是否可以将每个残基的信号分开并分配到3D固态NMR频谱，该光谱是根据溶液NMR确定的化学位移精确模拟的。结果，我们测量了相邻的C^α碳等的3D各向同性化学移位相关光谱，发现如果信号宽度约为1 ppm，几乎可以进行几乎所有信号分配。此外，在这个财政年度，我们使用了多维相关光谱来分配实际的肽 ^<13> c和 ^<15> n信号，并确认可以通过应用15个残基肽Mastparan X确定二级结构。尽管尚未达到亚基C的结构确定，但建立测量条件和测量方法为通过固态NMR确定未来结构的基础创造了基础。