リゾチームの塩酸グアニジン変性構造の解析

溶菌酶盐酸胍修饰结构分析

基本信息

批准号：
07280206
负责人：
藤原敏道
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Yokohama National University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07280206/
关键词：
変性構造リゾチーム蛋白質安定性塩酸グアニジン H-D交換

项目摘要

リゾチームについて円偏光二色性による研究から同じ変性状態でも温度変性とグアニジン変性では二次構造の存在が異なることが示唆されてる。一方、NMRによる研究より、熱変性状態の構造が完全なランダムコイルには至っていないことが示唆されている。そこで本研究ではNMRを用いて、卵白リゾチームの塩酸グアニジン変性と熱変性の比較を行った。実験としては、さまざまなpHおよび塩酸グアニジン濃度で、温度を変えて重水溶液中のニワトリ卵白リゾチームの^1H-NMRスペクトルの測定した。実験の結果、(1)pDの変化による変性温度はpD0.99から3.25まで変性温度が徐々に上昇していくが、それ以上のpDでは中性まで変性温度はほとんど変化しなかった。(2)0.5Mから3.0M塩酸グアニジン濃度までは、変性温度が徐々に下降して行くが、それ以上の塩酸ジアニジン濃度では6.0Mまで変性温度は10℃以下であった。(3)変性剤が存在する時も存在しない時も、変性した後、芳香環プロトン領域のスペクトルは温度とともに変化した。これはタンパク質の変性構造が温度に依存しているためであると考えられる。(4)pD2.5,3.0M以上の塩酸グアニジン存在下、10から30℃においては、変性状態でも交換しにくいアミドプロトンが存在した。これはCDから結論されているランダム構造と矛盾する。(5)pD2.5、6.0塩酸グアニジン存在下10℃において、NMRの信号強度の時間依存性から、アミドプロトンのHD交換速度を調べた。その半減期は5時間で20時間までは指数関数的に減少するが、それ以降はほとんど減少せず60時間後までもシグナルは残った。現在、これらアミドプロトンの信号同定し、変性構造の解析を行っている。

溶菌酶的圆二色性研究表明，即使在相同的变性状态下，温度变性和胍变性之间二级结构的存在也不同。另一方面，核磁共振研究表明，热变性状态下的结构并未达到完全无规卷曲。因此，本研究采用核磁共振技术比较了蛋清溶菌酶的盐酸胍变性和热变性。作为实验，在不同pH值和盐酸胍浓度以及不同温度下测量了重水溶液中鸡蛋清溶菌酶的^1H-NMR谱。实验结果表明：(1)由于pD的变化，变性温度从pD 0.99逐渐升高至3.25，但在较高的pD下，变性温度几乎保持不变，直至中性。 (2)盐酸胍浓度从0.5M到3.0M时，变性温度逐渐降低，但在盐酸二胍浓度较高时，变性温度一直保持在10℃以下直至6.0M。 (3)改性后，无论有无改性剂存在，芳环质子区的光谱均随温度变化。这被认为是因为蛋白质的变性结构是温度依赖性的。 (4)在pD为2.5、3.0M或更高的盐酸胍存在下，在10至30℃下，存在即使在变性状态下也难以交换的酰胺质子。这与从 CD 得出的随机结构相矛盾。 (5) pD2.5, 6.0 在10℃、盐酸胍存在下，根据NMR信号强度的时间依赖性研究酰胺质子的HD交换率。其半衰期为5小时，直至20小时呈指数下降，但此后几乎没有下降，甚至在60小时后信号仍然存在。我们目前正在识别这些酰胺质子的信号并分析它们的变性结构。