脂質二重膜にある蛋白質ナノ複合体の固体NMRによる原子分解能構造解析

使用固态 NMR 对脂质双层膜中的蛋白质纳米复合物进行原子分辨率结构分析

基本信息

批准号：
19042017
负责人：
藤原敏道
金额：
$ 3.97万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでの研究成果を発展させて、250残基程度の膜蛋白質の構造決定できる方法を確立する。具体的には、同位体標識法、脂質二重膜への再構成法が確立しているATP合成酵素サブユニットc及びハロロドプシンを対象にした。膜貫通している疎水領域と膜外にある親水領域は運動性の違いから、分別してスペクトルを単純化して測定した。また、さらに単純化するためにアミノ酸選択的同位体標識も行った。これらの新しい方法と蛋白質内の核間距離測定法と蛋白質と脂質分子間の距離測定法を組み合わせて、二重膜にある膜蛋白質の構造決定を行った。一連の立体構造情報を取得して、また、データ解析による構造決定として次のことを行った。化学シフトから得た二面角と距離相関から得た情報を組み合わせて構造決定を行った。距離相関の帰属は、スペクトル分解能の制約から容易ではない。しかい、部分的に行ったように、距離相関のスピン対への帰属と構造決定を同時に行う方法で、構造を収束させながら、その構造情報も利用して距離相関情報のスピン対への帰属を行った。蛋白質の構造をほぼ決めた後に、リン脂質二重膜や水層の水との相対的位置関係を決める。また、このことからハロロドプシンのオリゴマー構造やサブユニットcのリング状の構造を決定する。サブユニットcについては、F0リング回転機構について提案されているモデル、グルタミン酸の電荷による構造変化、側鎖構造の変化などを構造から検証した。ハロロドプシンについては、脂質二重膜内におけるオリゴマー状態を初めて構造決定することにより、その光異性化によるポンプとしての機能を解明した。

通过发展迄今为止获得的研究成果，我们将建立一种确定约250个残基的膜蛋白结构的方法。具体来说，我们针对 ATP 合酶 c 亚基和盐视紫红质，已建立了同位素标记方法和脂质双层膜的重构方法。由于穿透膜的疏水区域和膜外的亲水区域之间的迁移率存在差异，因此将光谱分离并测量以简化光谱。我们还对氨基酸进行了选择性同位素标记以进一步简化。通过将这些新方法与测量蛋白质内核间距离的方法以及测量蛋白质和脂质分子之间距离的方法相结合，我们确定了双层膜中膜蛋白的结构。我们获得了一系列3D结构信息，并执行以下操作以通过数据分析确定结构。通过结合从化学位移获得的二面角和从距离相关获得的信息来确定结构。由于光谱分辨率的限制，距离相关性的归因并不容易。然而，正如我们已经部分完成的那样，通过同时将距离相关性分配给自旋对并确定结构，在收敛结构的同时，我们还可以使用结构信息将距离相关性信息分配给自旋对，我做到了。。确定了蛋白质的结构后，就确定了磷脂双层膜和水层与水的相对位置。由此，我们还确定了盐视紫红质的寡聚体结构和c亚基的环状结构。对于c亚基，我们从结构上验证了所提出的F0环旋转机制、谷氨酸电荷引起的结构变化、侧链结构变化等的模型。通过首次确定脂质双层膜内寡聚状态的盐视紫红质的结构，我们通过光异构化阐明了其作为泵的功能。