核磁気共鳴法を用いた運動性の解析によるリゾチームのアミロイド線維形成機構の解明

通过核磁共振分析溶菌酶的运动性阐明其淀粉样原纤维形成机制

• 批准号: 04J04976
• 负责人: 加藤 秀典
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J04976/
• 关键词: フォールディング; リゾチーム; NMR; 重水素交換; 中間体; ヌクレオソーム; 安定性; アミロイド; 核磁気共鳴法

第一に、T4リゾチームのフォールディング反応を詳細に解析し、これまでの報告とは異なり、律速となる遷移状態の前に中間体は存在しないことを示した。一方、律速段階の後には中間体が一つ存在することを示し、その立体構造と運動性をNMRを用いて明らかにした。さらに20種類の変異体を作成し、野生型との安定性及びフォールディング速度の比較から、遷移状態の構造を明らかにした。以上の結果をまとめ、「Journal of Molecular Biology」誌に二本の論文として発表した。第二に、ヌクレオソームの構造とダイナミックスを、試験管内再構成系を用いて解析した。ショウジョウバエ由来の4種類のピストン(H2A, H2B, H3, H4)と、ヌクレオソーム局在化配列を12個タンデムに含む二本鎖DNAから、ヌクレオソームアレイを試験管内で再構成する実験系を確立した。再構成したヌクレオソームアレイが低濃度のMgCl_2の添加に伴い、さらにコンパクトに折れたたまった30nmクロマチン繊維を形成することを明らかにした。ピストンH2AがそのバリアントであるHtzに置換されることにより、ヌクレオソーム及び30nmクロマチン繊維の安定性が大きく変化することを見出した。ヌクレオソームを構成する(H2A-H2B)二量体、(H3-H4)_2四量体の解離について検討した。また、5SrRNA由来の146塩基対のDNAとピストン八量体から、モノヌクレオソームを再構成し、良質な結晶を得た。

首先，我们详细分析了T4溶菌酶的折叠反应，并表明与以前的报道不同，在限速过渡态之前不存在中间体。另一方面，显示出限速步骤后有一个中间体，并且使用NMR揭示了其三维结构和迁移率。创建了另外20个突变体，并通过将稳定性和折叠速率与野生型进行比较来揭示了过渡态的结构。上述结果总结并发表在《分子生物学杂志》上，作为两篇论文。其次，使用体外重建系统分析了核小体的结构和动力学。建立了一个实验系统，其中从四种类型的活塞（H2A，H2B，H3，H4）中重建核小体阵列，这些活塞源自果蝇和包含12个串联核小体定位序列的双链DNA。据表明，重建的核小体阵列形成更紧凑的破碎，并累积了30 nm的染色质纤维，并添加了低浓度的MGCL_2。发现替换活塞H2A及其变体HTZ显着改变了核小体和30 nm染色质纤维的稳定性。研究了构成核小体的（H2A-H2B）二聚体和（H3-H4）_2四聚体的解离。此外，从源自5sRRNA的146个基碱对DNA和活塞八聚体从146个基碱对DNA和活塞八聚体中重组，以获得高质量的晶体。