核磁気共鳴法を用いた運動性の解析によるリゾチームのアミロイド線維形成機構の解明

通过核磁共振分析溶菌酶的运动性阐明其淀粉样原纤维形成机制

基本信息

  • 批准号:
    04J04976
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 2.18万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for JSPS Fellows
  • 财政年份:
    2004
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2004 至 2006
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

第一に、T4リゾチームのフォールディング反応を詳細に解析し、これまでの報告とは異なり、律速となる遷移状態の前に中間体は存在しないことを示した。一方、律速段階の後には中間体が一つ存在することを示し、その立体構造と運動性をNMRを用いて明らかにした。さらに20種類の変異体を作成し、野生型との安定性及びフォールディング速度の比較から、遷移状態の構造を明らかにした。以上の結果をまとめ、「Journal of Molecular Biology」誌に二本の論文として発表した。第二に、ヌクレオソームの構造とダイナミックスを、試験管内再構成系を用いて解析した。ショウジョウバエ由来の4種類のピストン(H2A, H2B, H3, H4)と、ヌクレオソーム局在化配列を12個タンデムに含む二本鎖DNAから、ヌクレオソームアレイを試験管内で再構成する実験系を確立した。再構成したヌクレオソームアレイが低濃度のMgCl_2の添加に伴い、さらにコンパクトに折れたたまった30nmクロマチン繊維を形成することを明らかにした。ピストンH2AがそのバリアントであるHtzに置換されることにより、ヌクレオソーム及び30nmクロマチン繊維の安定性が大きく変化することを見出した。ヌクレオソームを構成する(H2A-H2B)二量体、(H3-H4)_2四量体の解離について検討した。また、5SrRNA由来の146塩基対のDNAとピストン八量体から、モノヌクレオソームを再構成し、良質な結晶を得た。
首先,我们详细分析了T4溶菌酶的折叠反应,结果表明,与之前的报道相反,在限速过渡态之前不存在中间体。另一方面,我们表明在限速步骤后存在一个中间体,并使用核磁共振阐明了其三维结构和迁移率。此外,还创建了20种突变体,通过与野生型比较稳定性和折叠速度,阐明了过渡态的结构。上述结果被总结并发表在《分子生物学杂志》上的两篇论文中。其次,使用体外重构系统分析核小体的结构和动力学。我们建立了一个实验系统,利用四种类型的果蝇衍生活塞(H2A、H2B、H3、H4)和含有 12 个串联核小体定位序列的双链 DNA 在体外重建核小体阵列。我们发现,添加低浓度的 MgCl_2 后,重建的核小体阵列形成了更紧凑折叠的 30 nm 染色质纤维。我们发现,当活塞 H2A 被其变体 Htz 取代时,核小体和 30 nm 染色质纤维的稳定性发生显着变化。我们研究了构成核小体的 (H2A-H2B) 二聚体和 (H3-H4)_2 四聚体的解离。此外,我们从5S rRNA和活塞八聚体衍生的146个碱基对DNA中重构了单核小体,并获得了高质量的晶体。

项目成果

期刊论文数量(1)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)

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