時分割ラウエ法による酵素反応機構の動的解析実験法の開発

时间分辨劳厄法动态分析酶反应机理实验方法的开发

基本信息

批准号：
08214204
负责人：
畑安雄
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでに、470アミノ酸残基からなるセラライシン族亜鉛プロテアーゼである緑膿菌アルカリプロテアーゼの立体構造を決定し、N末端側活性ドメインとC末端側βヘリックスドメインの二つのドメインからなる分子であることを明らかにしてきた。結晶学的解析の次の段階として、阻害剤との複合体の構造を解析し、酵素自身の構造と比較して得られる構造変化に基づいて反応機構解析を行うのが通常の方法である。しかし、阻害剤を用いる方法を動的結晶構造解析に適用することはできない。そこで、反応機構を動的結晶解析により研究するため、pHジャンプによるトリガー法の開発を行うことにした。まず、動的解析の可能性を有する四残基からなるペプチド基質Z-A-G-G-L-OHと緑膿菌アルカリプロテアーゼとでペプチド基質を分解されない状態で酵素に結合させたミカエリスーメンテン型複合体結晶をpH5.6で調製し、その構造解析を行った。得られた結果は、pHジャンプ法での時分割結晶解析法を本複合体へ適用して酵素反応過程の動的研究を行うことの可能性を示唆するものであった。そこで、次に本複合体結晶のpHを結晶化pH(5.6)から至適pH(8.0)へジャンプさせて反応トリガーをかけることによって、この方法の適用を試みることにした。しかし、pHをジャンプさせることによる環境変化によって緑膿菌アルカリプロテアーゼの複合体結晶は溶解した。これを避けるためにグルタルアルデヒドによる結晶表面での分子間架橋法を用いることにし、条件検索を行った。その結果、0.25%グルタルアルデヒドに1時間浸漬して架橋した結晶の場合に得られたラウエ像は、この方法で調製した結晶の動的解析への適合性を支持するものであった。従って、この方法を用いれば、pHジャンプで白色ラウエ法による時分割動的結晶解析が可能になることが分かった。

迄今为止，我们已经确定了铜绿假单胞菌碱性蛋白酶（一种由470个氨基酸残基组成的seralysin家族锌蛋白酶）的三维结构，并确定其是由两个结构域组成的分子：N端活性结构域和C端β螺旋结构域已明确。晶体分析后的下一步是分析与抑制剂的复合物的结构，并将其与酶本身的结构进行比较，根据由此产生的结构变化来分析反应机理。然而，使用抑制剂的方法不能应用于动态晶体结构分析。因此，为了利用动态晶体分析研究反应机理，我们决定开发一种利用pH跳跃的触发方法。首先，我们制备了一种Michaelis-Menten型复合晶体，其中具有动态分析潜力且由四个残基组成的肽底物Z-A-G-G-L-OH和铜绿假单胞菌碱性蛋白酶与酶6及其不被降解结合。结构进行了分析。所获得的结果表明，可以将使用pH跃变方法的时间分辨晶体学应用于该复合物，以对该复合物进行酶促反应过程的动态研究。因此，我们接下来尝试通过将复杂晶体的pH值从结晶pH值(5.6)跳跃到最佳pH值(8.0)来触发反应来应用该方法。然而，由于pH值突变引起的环境变化，铜绿假单胞菌碱性蛋白酶复合物晶体被溶解。为了避免这种情况，我们决定采用戊二醛在晶体表面进行分子间交联的方法，并进行了条件搜索。结果，通过在0.25％戊二醛中浸泡1小时而交联的晶体获得的劳厄图像支持了通过该方法制备的晶体用于动态分析的适用性。因此，发现通过使用该方法，可以利用怀特劳厄法进行具有pH跳变的时间分辨动态晶体分析。