古細菌2-オキソ酸:フェレドキシン酸化還元酵素群の構造生物学研究

古菌2-含氧酸：铁氧还蛋白氧化还原酶组的结构生物学研究

基本信息

批准号：
13033020
负责人：
畑安雄
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究ではこれまでに[Fe-S]クラスター生合成系酵素の、一つでピリドキサール5'-リン酸(PLP)依存酵素である大腸菌CsdBの酵素自身、極低反応性基質であるアスパラギン酸との複合体および自殺基質であるプロパルギルグリシンとの複合体(反応中間体複合体)のX線結晶構造解析を2.8Å分解能で行ない、これらの立体構造を決定してきた。本年度は研究最終年度であるので、過去3年間のX線結晶構造解析の結果を用いて立体構造比較を行ない、NifS相同タンパク質の反応機構を考察した。本酵素の複合体の全体構造は酵素自身の構造と類似しており、複合体を形成しても大きな構造変化がおこらなかった。しかし、アスパラギン酸との複合体ではPLPは酵素のみの場合と同様にLys226とインターナルアルディミン結合をしており、ミカエリス型の複合体を形成していた。一方、プロパルギルグリシンとの複合体ではプロパルギルグリシンはPLPとシッフ塩基を形成し、活性部位でエックスターナルアルディミンが形成されていた。L-システインに対する活性発現には必要であるがL-セレノシステインに対しては必ずしも必要ではないCys364は解析したいづれの場合においても伸長部(Thr362-Arg375)ループ中にはっきりと現れていた。これは、L-システインに高い活性を示す酵素であるIscSと近い関係にあるThermotoga maritima由来NifS-相同タンパク質のディスオーダーしたループ部(Ser321-Arg332)とは対照的であった。CsdBの伸長ループはThermotoga maritima由来NifS-相同タンパク質と比べて11残基短くなっている。これらの事実は、CsdBのCys364を含む伸長ループの柔軟性が制限されていることが、CsdBがセレンとイオウを区別できる原因であるかも知れない。

在这项研究中，我们证明，大肠杆菌 CsdB 的酶是 [Fe-S] 簇生物合成酶之一，依赖于 5'-磷酸吡哆醛 (PLP)，能够与天冬氨酸相互作用，天冬氨酸是一种极其重要的物质。我们以2.8 Å的分辨率对与硅化物底物炔丙基甘氨酸的配合物以及与硅化物底物炔丙基甘氨酸的配合物（反应中间配合物）进行了X射线晶体结构分析，并确定了它们的三维结构。由于今年是研究的最后一年，我们利用过去三年的X射线晶体结构分析结果比较了三维结构，并思考了NifS同源蛋白的反应机制。该酶复合物的整体结构与酶本身的结构相似，复合物形成时没有发生大的结构变化。然而，在与天冬氨酸的复合物中，PLP 与 Lys226 具有内部醛亚胺键，形成米氏型复合物，就像单独酶的情况一样。另一方面，在与炔丙基甘氨酸的复合物中，炔丙基甘氨酸与PLP形成席夫碱，并在活性位点形成外部醛亚胺。 Cys364 是表达针对 L-半胱氨酸的活性所必需的，但不一定针对 L-硒代半胱氨酸，在所有分析的情况下，它都清楚地存在于扩展环 (Thr362-Arg375) 中。这与来自海栖热袍菌的 NifS 同源蛋白的无序环区域 (Ser321-Arg332) 形成鲜明对比，后者与 IscS（一种对 L-半胱氨酸表现出高活性的酶）密切相关。 CsdB 的延伸环比来自海栖热袍菌的 NifS 同源蛋白的延伸环短 11 个残基。这些事实表明，CsdB含有Cys364的延伸环的灵活性有限可能是CsdB能够区分硒和硫的原因。