亜鉛プロテアーゼの基質分解機構と反応中での亜鉛の役割に関する構造研究

锌蛋白酶底物分解机理及锌在反应中作用的结构研究

基本信息

批准号：
09235214
负责人：
畑安雄
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

X線結晶解析により明らかになったN末端側活性ドメインとC末端部βヘリックスドメインから成るセラライシン亜鉛プロテアーゼの構造に基づく部位特異的変異実験を行い、各ドメインの構造と機能の関係について検討した。N末端側活性ドメイン中の亜鉛配位子のうち、コンセンサス配列HEXXHXXGXXH(X:任意残基)中にあって活性残基Glu177の隣にある亜鉛配位子His176をLeuに変異させると酵素は活性を失うことが分かった。その原因として、配位構造の変化と亜鉛イオン周辺の電荷分布の変化の二つが考えられる。ロイシンは亜鉛配位子にはなれないために、恐らく配位構造が三方両錐型五配位から変形四面体型四配位へと変化するであろうし、変異によって疎水性が増し亜鉛およびその周辺の正電荷が減少して切断されるペプチド結合を構成するカルボニル基の電荷分布も変化して水の酸素による求核攻撃も起りにくくなるであろうから、酵素が失活すると考えられる。一方、C末端側βヘリックス構成ドメインには、前六残基のカルシウム結合配列と後三残基のβ鎖配列からなる九残基コンセンサス配列GGXGXDXUX(U:かさ高い疎水性残基で通常はロイシン)の繰り返しが存在し、Ca^<2+>イオンがカルシウム結合ループに結合してフォールディングが完成して成熟酵素になることが結晶構造から考えられた。そこで、ドメイン中央の規則的βヘリックス形成に寄与するAsp356或いはAsp365をアラニンに変異させてCa^<2+>イオンが結合できなくすると酵素は活性を失った。これらの位置は、活性亜鉛から約40離れていて活性部とは直接的接触はない。しかし、これらの残基の変異で酵素が失活したことから、Ca^<2+>イオンの結合によるβヘリックス形成がセラライシン・ファミリーに属する亜鉛プロテアーゼ酵素の成熟化に繋がることが明らかになった。

我们根据X射线晶体学揭示的seralysin锌蛋白酶的结构进行了定点突变实验，该结构由N端活性结构域和C端β螺旋结构域组成，并研究了结构之间的关系以及每个域的功能。在N端活性结构域的锌配体中，当位于共有序列HEXXHXXGXXH（X：任意残基）中活性残基Glu177旁边的锌配体His176突变为Leu时，酶变得有活性I。发现我会输。造成这种情况的两个可能原因是配位结构的变化和锌离子周围电荷分布的变化。由于亮氨酸不能成为锌配体，因此配位结构可能从三角双锥体五配位变为修饰的四面体四配位，并且该突变增加了疏水性，使得锌及其周围的酶难以结合。由于正电荷减少，构成断裂肽键的羰基的电荷分布发生变化，从而变得不活泼，难以发生水氧的亲核攻击。另一方面，C端β-螺旋组成结构域含有九残基共有序列GGXGXDXUX（U：大的疏水残基，通常是亮氨酸）重复存在，晶体结构表明Ca^2+离子结合到钙结合环完成折叠并成为成熟的酶。因此，当有助于在结构域中心形成规则β-螺旋的Asp356或Asp365突变为丙氨酸以阻止Ca 2+ 离子结合时，酶失去其活性。这些位置距活性锌约40毫米，与活性位点没有直接接触。然而，这些残基的突变使酶失活，表明由于Ca 2+ 离子的结合而形成的β-螺旋导致属于seralysin家族的锌蛋白酶的成熟。