亜鉛プロテアーゼの基質分解機構と反応中での亜鉛の役割に関する構造研究

锌蛋白酶底物分解机理及锌在反应中作用的结构研究

• 批准号: 09235214
• 负责人: 畑 安雄
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09235214/
• 关键词: セラチアプロテアーゼ; アルカリプロテアーゼ; 亜鉛プロテアーゼ; X線結晶解析; 部位特異的変異; セラチアプロテアーゼ; アルカリプロテアーゼ; 亜鉛プロテアーゼ; X線結晶解析; 部位特異的変異

X線結晶解析により明らかになったN末端側活性ドメインとC末端部βヘリックスドメインから成るセラライシン亜鉛プロテアーゼの構造に基づく部位特異的変異実験を行い、各ドメインの構造と機能の関係について検討した。N末端側活性ドメイン中の亜鉛配位子のうち、コンセンサス配列HEXXHXXGXXH(X:任意残基)中にあって活性残基Glu177の隣にある亜鉛配位子His176をLeuに変異させると酵素は活性を失うことが分かった。その原因として、配位構造の変化と亜鉛イオン周辺の電荷分布の変化の二つが考えられる。ロイシンは亜鉛配位子にはなれないために、恐らく配位構造が三方両錐型五配位から変形四面体型四配位へと変化するであろうし、変異によって疎水性が増し亜鉛およびその周辺の正電荷が減少して切断されるペプチド結合を構成するカルボニル基の電荷分布も変化して水の酸素による求核攻撃も起りにくくなるであろうから、酵素が失活すると考えられる。一方、C末端側βヘリックス構成ドメインには、前六残基のカルシウム結合配列と後三残基のβ鎖配列からなる九残基コンセンサス配列GGXGXDXUX(U:かさ高い疎水性残基で通常はロイシン)の繰り返しが存在し、Ca^<2+>イオンがカルシウム結合ループに結合してフォールディングが完成して成熟酵素になることが結晶構造から考えられた。そこで、ドメイン中央の規則的βヘリックス形成に寄与するAsp356或いはAsp365をアラニンに変異させてCa^<2+>イオンが結合できなくすると酵素は活性を失った。これらの位置は、活性亜鉛から約40離れていて活性部とは直接的接触はない。しかし、これらの残基の変異で酵素が失活したことから、Ca^<2+>イオンの結合によるβヘリックス形成がセラライシン・ファミリーに属する亜鉛プロテアーゼ酵素の成熟化に繋がることが明らかになった。

X射线晶体学揭示了基于N端活性结构域和C末端β-螺旋结构蛋白的结构，该突变实验是根据Ceralysin锌蛋白酶的结构进行的，该结构由X射线晶体学揭示了N端活动结构域和C端β-螺旋结构域，并研究了每个域的结构和功能之间的关系。已经发现，位于共有序列his176的Leu突变，该突变位于共识序列hexxhxxgxxh（任何残基）旁边的活性残基GLU177旁边的突变，从而失去了活性。两个可能的原因是：协调结构的变化和锌离子周围电荷分布的变化。由于亮氨酸不能成为锌配体，因此其协调结构可能会从三角双翅类五型五坐标到变形的四面体四面体四面化，突变会增加疏水性和周围的构成构成的构成群体的构成群体的构成群体，并会增加氧化的正电荷，从而改变核能的构成，从而改变coloy的正电荷。是由水氧引起的，从而使酶停用的可能性较小。另一方面，C末端β-螺旋共识结构域重复了九分散共识序列GGXGXDXUX（U：通常是笨重的疏水残基，通常是亮氨酸），由6个残基的钙结合序列组成，并由Pre-6残基的结合序列和β-链结构的结构^+ca^ca的结构^++the+ca^ca^ca^ca+ca y+ca^ca y+the。与钙结合环的结合，导致折叠并成为成熟的酶。因此，当将中心结构域的常规β-螺旋形成的ASP356或ASP365突变为丙氨酸以防止Ca^<2+>离子的结合时，酶会失去活性。这些位置与活动锌分开约40个，并且与活动部分没有直接接触。然而，这些残基中的突变导致酶失活，并且已经表明，通过Ca^<2+>离子结合的β-螺旋形成导致属于Cerarycin家族的锌蛋白酶成熟。