亜鉛プロテアーゼの基質分解機構と反応中での亜鉛の役割に関する構造研究

锌蛋白酶底物分解机理及锌在反应中作用的结构研究

基本信息

批准号：
08249220
负责人：
畑安雄
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

セラチアプロテアーゼと緑膿菌アルカリプロテアーゼは、活性部近傍のMet‐ターンで特徴付けられるメトジンシン・スーパーファミリーを構成するセラライシン族の亜鉛プロテアーゼである。両酵素は、亜鉛結合モチーフ中の三つのHis,水分子およびMet‐ターン中のTyrが配位した特異な五配位構造をとる活性亜鉛を有し、保存配列Y190‐N‐A‐G‐E‐G‐D196、九残基モチーフ配列GGXGXDXUX(U:かさ高い残基でLが多い)の反復および多くのカルシウムイオンを含む特徴持っている。申請者は、両酵素のX線結晶解析を行い、約470アミノ酸残基からなる両酵素の立体構造が良く似ていることを明らかにした。両酵素は、N末端側の亜鉛を含む活性ドメインとN末端αヘリックスを伴ったC末端側の構造ドメインからなる。N末端ドメインは、活性亜鉛を取り囲む様に五本鎖逆平行βシートと三本のαヘリックスが存在するトポロジー的にメトジンシン酵素に共通する構造をとる。一方、C末端ドメインは、九残基モチーフ配列中の前六残基ループと後三残基β鎖が交互に反復して右巻ヘリックス状に並んで出来る二枚の平行βシートが逆平行に重なったβヘリックス構造をとっている。カルシウムイオンは、ループに結合して分子内部に保持されている。更に緑膿菌アルカリプロテアーゼとペプチド基質の複合体の結晶解析の結果、基質結合時の構造変化が観察された。基質は、活性ドメインの五本鎖βシートの四番目β鎖と水素結合で逆平行に結合して主鎖カルボニルを亜鉛に配位させる。この配位によって亜鉛から離れたTyr216が、活性部入口を塞ぐように移動した保存ループ(Y190‐D196)中のAsn191と水素結合して安定化する。このことから、活性亜鉛は、基質が分解されるまでのあいだ基質を安定化させる働きをしていることが分かった。

沙雷氏菌蛋白酶和铜绿假单胞菌碱性蛋白酶是 Serralysin 家族的锌蛋白酶，它们是 Metzincin 超家族的成员，其特征是在活性位点附近有 Met 转角。两种酶均在独特的五配位结构中含有活性锌，由锌结合基序中的三个组氨酸、一个水分子和 Met 转角中的酪氨酸协调，并表征了保守序列 Y190-NA-G-E-G-D196通过重复九个残基基序序列 GGXGXDXUX（U：具有许多 L 的大残基）并含有许多钙离子。申请人对两种酶进行了X射线晶体分析，发现两种酶的三维结构非常相似，均由约470个氨基酸残基组成。两种酶均由 N 端含锌活性结构域和带有 N 端 α 螺旋的 C 端结构域组成。 N 末端结构域具有与 metzincin 酶相同的拓扑结构，具有五链反向平行 β 片层和三个围绕活性锌的 α 螺旋。另一方面，C 末端结构域由两个平行的 β 折叠组成，这两个 β 折叠由九残基基序序列中的第一个六残基环和最后一个三残基 β 链交替重复形成，并以右侧排列。手螺旋，形成反向平行结构，具有重叠的β螺旋结构。钙离子通过与环结合而被保留在分子内部。此外，对铜绿假单胞菌碱性蛋白酶和肽底物的复合物进行晶体分析，结果观察到底物结合时结构发生变化。底物通过氢键与活性结构域五链β-折叠的第四条β-链反向平行结合，从而将主链羰基与锌配位。由于这种配位，与锌分离的 Tyr216 通过与保守环 (Y190-D196) 中的 Asn191 形成氢键而稳定，Asn191 已移动以阻止活性区域的入口。这表明活性锌起到稳定基质直到其分解的作用。