ATP結合蛋白質のラウエ法による動的結晶解析のための実験法の開発

使用劳厄法开发 ATP 结合蛋白动态晶体分析的实验方法

基本信息

批准号：
05244201
负责人：
畑安雄
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

生体反応の担い手である酵素のなかにはATPを補酵素として利用するものが数多くある。これらの酵素反応機構を理解するうえで時分割ラウエ法による動的結晶解析は有力な方法である。しかし、この方法を一般化するためには実験するうえで解決しなければならない問題が幾つかある。そこでX線結晶解析により既に2A分解能で立体構造を決定した大腸菌由来グルタチオン合成酵素を用いてラウエ実験法の開発を行った。まず動的構造解析するためには静的構造を精度良く解析して酵素の構造のみならず基質の結合位置および結合時の構造変化を明らかにしておく必要がある。本酵素の基質であるATPとγ-Glu-Cysを結合した複合体酵素の結晶を調製し、放射光を用いて収集した回折強度データを用いて立体構造を決定した。その構造と酵素自身の構造とを比較して基質の結合場所および結合時の構造変化を明らかにした。酵素中に含まれるフレキシブルループは、基質が結合しても固定された構造を採らないことが判った。次にラウエ実験に適する反応速度を実現するために変異酵素を調製した。ATP結合に関与すると思われるアルギニンをリジンに変えた変異酵素R210Kの反応速度は野生型酵素の1/500で、反応速度をもう一桁遅くするとラウエ実験に適することが判った。従って、低温で実験すればよいと思われる。ラウエ実験には高品質の結晶が必要である。本酵素の場合、種々の沈澱剤で結晶化したが、質は殆ど変わらなかった。むしろ、同じバッチの結晶でも質が異なり、一般に少し小さめの結晶の方が質が良いことが判った。flash photolysisによる反応トリガー法は、光の強さや結晶の大きさに依存するので条件を一定にするのが難しかった。更に追求する必要がある。以上の結果は一般的に適用できるものであると思われる。今後、Zn-プロテアーゼの反応機構解析にも適用してみる予定である。

许多负责生物反应的酶都使用 ATP 作为辅酶。使用时间分辨劳厄法进行动态晶体分析是了解这些酶反应机制的有效方法。然而，为了推广该方法，实验中必须解决几个问题。因此，我们开发了使用大肠杆菌衍生的谷胱甘肽合酶的劳厄实验方法，该酶的三维结构已通过X射线晶体学以2A分辨率确定。首先，为了分析动态结构，需要准确分析静态结构，不仅要弄清楚酶的结构，还要弄清楚底物的结合位置以及结合后的结构变化。制备复合酶的晶体，该复合酶结合了该酶的底物ATP和γ-Glu-Cys，并使用同步加速器辐射收集的衍射强度数据确定了三维结构。通过将其结构与酶本身的结构进行比较，我们阐明了底物的结合位点以及结合后的结构变化。发现即使当底物结合时，酶中包含的柔性环也不会采用固定结构。接下来，制备了突变酶以达到适合劳厄实验的反应速率。突变型酶R210K（其中被认为参与ATP结合的精氨酸改变为赖氨酸）的反应速度是野生型酶的1/500，并且发现反应速度变慢一个数量级将适合劳厄实验。因此，在低温下进行实验似乎是合适的。劳厄实验需要高质量的晶体。对于这种酶，使用各种沉淀剂使其结晶，但质量几乎保持不变。事实上，人们发现，即使是同一批次的晶体，其品质也存在差异，一般来说，尺寸稍小的晶体质量会更好。使用闪光光解的反应触发方法很难维持恒定的条件，因为它取决于光的强度和晶体的尺寸。我们需要进一步追求这一点。上述结果看来具有普遍适用性。未来，我们计划将该方法应用于Zn-蛋白酶反应机理的分析。