時分割ラウエ法による酵素反応機構の動的解析実験法の開発

时间分辨劳厄法动态分析酶反应机理实验方法的开发

基本信息

批准号：
06235204
负责人：
畑安雄
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

セラチア菌プロテアーゼと緑膿菌アルカリプロテアーゼの二種のZnプロテアーゼ(分子量約5万)の反応機構を時分割ラウエ法を適用して原子レベルで解明するには、良質結晶調製法や反応トリガー技術の開発、反応速度低下法と中間体捕獲法の確立などの実験法の開発が必要である。それには、まず基礎となる両酵素の静的構造を高分解能で精度よく決定する必要がある。アミノ酸配列に60%相同性を有するセラチアプロテアーゼと緑膿菌アルカリプロテアーゼのX線結晶構造解析を独立に行い、両酵素とも2.0Åという高分解能にもかかわらずR因子19%の高精度で構造を決定した。その結果、両酵素はβ-ヘリックスと呼ばれる新規構造を含む類似の立体構造を有する同じ酵素ファミリーに分類されうることが明らかになった。更に動的構造解析によって反応メカニズムを明らかにするために重要な酵素/阻害剤複合体の静的構造の決定を試みた。酵素/阻害剤複合体の結晶構造を解析し、酵素自身の構造と比較することによって基質結合時の酵素の構造変化及び基質結合様式を明らかにすることができる。両酵素に対するタンパク質性阻害剤としては現在のところα2マクログロブリンのみしか発見されていない。α2マクログロブリンは、高分子量タンパク質で本目的には適しない。そこで、ペプチド性阻害剤を調製して解析に用いた。この阻害剤は、動的構造解析のための阻害剤/基質転移物質を開発するうえで基本になると期待されるものである。差フーリエ合成法による解析の結果、阻害剤は酵素の活性部近傍に結合しているものの、阻害剤の溶解度が低いこともあって占有率に改良の余地があることが判った。今後この点を改良して活性部の構造を解明し、pHジャンプによる反応開始トリガー法の開発を行なう。

为了阐明两种类型的Zn蛋白酶（约50,000个分子量），使用时间划分的劳动法在原子水平上的血清和铜绿假单胞菌碱性蛋白酶的反应机制，有必要开发高质量的晶体制备方法，反应触发方法和实验方法，例如，反应方法和反应速率进行了反应速率和重新建立的方法。为此，有必要首先确定具有高分辨率且精度高的基础酶的静态结构。独立执行了与氨基酸序列具有60％同源性的60％同源性的血清蛋白酶和铜绿假单胞菌的X射线晶体结构分析，尽管两种酶的高分辨率高2.0a。结果表明，这两种酶都可以分为具有相似三维结构的同一酶家族，包括一种称为β-螺旋的新结构。此外，我们试图确定酶/抑制剂复合物的静态结构，这很重要，以通过动态结构分析来阐明反应机理。通过分析酶/抑制剂复合物的晶体结构并将其与酶自身的结构进行比较，可以揭示酶在底物结合和底物结合模式时的结构变化。目前，仅发现α2大球蛋白是两种酶的蛋白质抑制剂。 α2大球蛋白是一种高分子量蛋白，不适合此目的。因此，制备肽抑制剂并用于分析。预计该抑制剂将在开发抑制剂/底物转移剂进行动态结构分析方面至关重要。通过差异傅里叶合成方法分析表明，尽管抑制剂与酶的活性部分附近结合，但占用率仍具有低溶解度，这意味着有改善的余地。将来将改善这一点，以阐明活性部分的结构，并使用pH跳跃开发反应启动触发方法。