時分割ラウエ法による酵素反応機構の動的解析実験法の開発

时间分辨劳厄法动态分析酶反应机理实验方法的开发

基本信息

批准号：
06235204
负责人：
畑安雄
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

セラチア菌プロテアーゼと緑膿菌アルカリプロテアーゼの二種のZnプロテアーゼ(分子量約5万)の反応機構を時分割ラウエ法を適用して原子レベルで解明するには、良質結晶調製法や反応トリガー技術の開発、反応速度低下法と中間体捕獲法の確立などの実験法の開発が必要である。それには、まず基礎となる両酵素の静的構造を高分解能で精度よく決定する必要がある。アミノ酸配列に60%相同性を有するセラチアプロテアーゼと緑膿菌アルカリプロテアーゼのX線結晶構造解析を独立に行い、両酵素とも2.0Åという高分解能にもかかわらずR因子19%の高精度で構造を決定した。その結果、両酵素はβ-ヘリックスと呼ばれる新規構造を含む類似の立体構造を有する同じ酵素ファミリーに分類されうることが明らかになった。更に動的構造解析によって反応メカニズムを明らかにするために重要な酵素/阻害剤複合体の静的構造の決定を試みた。酵素/阻害剤複合体の結晶構造を解析し、酵素自身の構造と比較することによって基質結合時の酵素の構造変化及び基質結合様式を明らかにすることができる。両酵素に対するタンパク質性阻害剤としては現在のところα2マクログロブリンのみしか発見されていない。α2マクログロブリンは、高分子量タンパク質で本目的には適しない。そこで、ペプチド性阻害剤を調製して解析に用いた。この阻害剤は、動的構造解析のための阻害剤/基質転移物質を開発するうえで基本になると期待されるものである。差フーリエ合成法による解析の結果、阻害剤は酵素の活性部近傍に結合しているものの、阻害剤の溶解度が低いこともあって占有率に改良の余地があることが判った。今後この点を改良して活性部の構造を解明し、pHジャンプによる反応開始トリガー法の開発を行なう。

为了应用时间分辨劳厄法在原子水平上阐明两种锌蛋白酶（分子量约为50,000）沙雷氏菌蛋白酶和铜绿假单胞菌碱性蛋白酶的反应机理，需要使用高质量的晶体需要开发反应速率降低方法和中间体捕获方法的建立等实验方法。为此，首先需要以高分辨率和精确度确定两种酶的基本静态结构。独立对氨基酸序列具有60%同源性的沙雷氏菌蛋白酶和铜绿假单胞菌碱性蛋白酶进行X射线晶体结构分析，并以19%的R因子高精度确定了两种酶的结构。决定采用2.0 Å的高分辨率。结果表明，这两种酶可以归类为具有相似三维结构的同一酶家族，其中包括一种称为β螺旋的新结构。此外，我们试图通过动态结构分析来确定酶/抑制剂复合物的静态结构，这对于阐明反应机制非常重要。通过分析酶/抑制剂复合物的晶体结构并将其与酶本身的结构进行比较，可以阐明酶在底物结合时的结构变化以及底物结合模式。目前，仅发现α2-巨球蛋白作为这两种酶的蛋白质抑制剂。 α2巨球蛋白是一种高分子量蛋白质，不适合此用途。因此，制备了肽抑制剂并用于分析。该抑制剂有望成为开发用于动态结构分析的抑制剂/底物转移物质的基础。使用微分傅立叶合成法进行分析的结果发现，虽然抑制剂结合在酶的活性位点附近，但由于抑制剂的溶解度较低，因此占有率仍有改善的空间。未来，我们将改进这一点，阐明活性部分的结构，并开发一种通过pH跳跃触发反应引发的方法。