時分割ラウエ法による酵素反応機構の動的解析実験法の開発

时间分辨劳厄法动态分析酶反应机理实验方法的开发

基本信息

批准号：
07224203
负责人：
畑安雄
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

亜鉛プロテアーゼの原子レベルでの反応機構の解明を通じて時分割ラウエ法による動的結晶解析法を開発するため、セラチア菌プロテアーゼと緑膿菌アルカリプロテアーゼの二種のZnプロテアーゼの反応機構解析を進めてきた。既に両酵素の立体構造を明らかすることができた。この成果を踏まえて阻害剤や基質類似物との複合体のX線結晶解析を行い、基質結合時の酵素および基質の立体構造変化を解析した。リガンドとして阻害剤一種類(peptidyl mercaptoanilide誘導体)および合成ペプチド二種類(Z-Ala-Gly-Gly-Leu、Ac-Tyr-Val-Gly)を用いていずれも10mM濃度の水溶液に母結晶を浸漬して複合体結晶を調製した。酵素が塩基性アミノ酸残基のC末端側のペプチド結合を好んで加水分解する性質があることから、Bz-Phe-Arg基を有する阻害剤をアセトン60%を含む結晶化溶媒に溶かして用いた。R-AXIS IICで収集した回折データと酵素分子の座標パラメータから計算した位相とを用いて得られた差フーリエ図は、リガンド結合様式および酵素の構造変化を明確に表すものであった。この解析から次の様な事が明らかとなった。基質が酵素活性部に接近してきて主鎖のカルボニル酸素を活性亜鉛に配位させて酵素に結合すると、第五配位子であったY216は亜鉛から離れて基質と水素結合して基質を安定化させる。更に、活性部入り口にある柔軟性に富んだループ(Y190-D196)は入り口を閉じるように構造を変化させて基質と水素結合し、基質を安定化させる。基質と酵素に観られるこのようなコンフォメーション変化が起こる順序は明確ではないけれど、この構造変化が基質の酵素による加水分解反応に重要であるに違いない。この結果は、時分割ラウエ法での動的結晶解析による酵素反応機構解明に向けての大きな進歩であるといってよいであろう。

为了开发一种使用时间分辨劳厄法的动态晶体分析方法，从原子水平阐明锌蛋白酶的反应机理，我们对沙雷氏菌蛋白酶和假单胞菌属两种锌蛋白酶的反应机理进行了分析。铜绿假单胞菌碱性蛋白酶。我们已经能够阐明这两种酶的三维结构。基于这一结果，我们对抑制剂和底物类似物的复合物进行了X射线晶体学分析，并分析了底物结合时酶和底物的构象变化。使用一种抑制剂（肽基巯基苯胺衍生物）和两种合成肽（Z-Ala-Gly-Gly-Leu、Ac-Tyr-Val-Gly）作为配体，将母晶浸入含制备浓度为10mM的复合晶体。由于酶倾向于优先水解碱性氨基酸残基 C 端侧的肽键，因此我们使用了溶解在含有 60% 丙酮的结晶溶剂中的 Bz-Phe-Arg 基团抑制剂。利用R-AXIS IIC收集的衍射数据和根据酶分子的坐标参数计算出的相位得到的差分傅立叶图清楚地表达了配体结合模式和酶的结构变化。该分析揭示了以下内容。当底物接近酶的活性部分并通过主链的羰基氧与活性锌配位而与酶结合时，第五配体Y216与锌分离并与底物形成氢键以稳定底物。成为此外，有源区入口处的高柔性环路（Y190-D196）改变其结构以封闭入口并与衬底形成氢键，从而稳定衬底。尽管在底物和酶中观察到的这些构象变化发生的顺序尚不清楚，但这种结构变化对于底物的酶水解一定很重要。这一结果可以说是利用时间分辨劳厄法的动态晶体分析阐明酶反应机制的重大进步。