ハロ酸分解性微生物酵素の遺伝子工学的研究と環境浄化への応用

卤酸降解微生物酶基因工程研究及其在环境净化中的应用

基本信息

批准号：
06271240
负责人：
左右田健次
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Pseudomonas sp.YLのL-2-ハロ酸デハロゲナーゼは、L-2-ハロ酸の加水分解的脱ハロゲン反応を触媒し、対応するD-2-ヒドロキシ酸を与える。本酵素の触媒反応機構を解析した。1分子の酵素が1回だけ反応を触媒するSingle Turnoverの反応と、1分子の酵素が複数回反応を触媒するMultiple Turnoverの反応をH_2^<18>O中で行い、生成物2-ヒドロキシ酸への^<18>Oの取り込みの有無を調べた。L-2-クロロプロピオン酸を基質としたところ、生成物乳酸への^<18>Oの取り込みはMurltiple Turnoverの反応でのみ認められた。これは、溶媒の水分子の酸素原子が、いったん酵素分子に取り込まれた後、基質に取り込まれたことを示唆している。H_2^<18>O中で反応を行った酵素をプロテアーゼで分解し、得られたペピチド断片をタンデムMS/MS法で分析した結果、Asp10に^<18>Oが取り込まれていることが明らかとなった。以上の結果から、酵素のAsp10の側鎖カルボキシル基が基質のα-炭素を攻撃してハライドイオンが脱離し、生成したエステル中間体が溶媒の水分子によって加水分解されて2-ヒドロキシ酸が遊離するという機構で、反応が進行するものと考えられた。DL-2-ハロ酸デハロゲナーゼは、2-ハロ酸の両異性体に作用し、立体反転で対応する2-ヒドロキシ酸を与える。Pseudomonas sp.113から本酵素の遺伝子を単離し、塩基配列を決定した。ORFは921bpからなり、307アミノ酸をコードしていた。推定分子量は34,242で精製酵素のサブユニット分子量と良い一致を示した。本酵素は、D-体のハロ酸に特異的に作用するD-2-ハロ酸デハロゲナーゼと21.5%の相同性を示した。

假单胞菌Sp.yl的L-2-Halo-Halo遗传被L-2-Halo酸的卤素反应催化，得出相应的D-2-羟基酸。分析了该酶的催化反应机制。单个周转率的反应，其分子酶仅催化一次，并且在H_2^<18> O中进行了多次单分子酶催化多次催化的多个周转率的反应。我检查了O.我检查了O的存在或不存在O <18>O。当将L-2-氯二酸用作底物时，仅在murltiph的转离反应中才能识别为乳酸^<18> O的掺入。这表明溶剂水分子的氧原子曾经被掺入酶分子中，然后掺入底物中。在O中反应的H_2^<18> O酶与蛋白酶分解，并用串联MS/MS方法分析了所获得的pepitide片段，很明显，^<18> O已掺入ASP10。基于上述结果，酶的侧链羧基攻击底物的α-碳，并且较硬的离子已取走，并且产生的酯中间体被溶剂水分子水解，2-羟基酸是释放。 DL-2-HALO HALO GENASE作用于两峰酸的双特异性体，并产生与三维反转相对应的2-羟基酸。从假单胞菌Sp.113闲置了该酶的基因，并确定了碱基序列。 ORF由921 bp组成，编码为307个氨基酸。估计的分子量为34,242，与纯化酶的亚基分子量匹配。该酶与D-2-Halo-Halo-Halogenase的斑点气度为21.5％，该酶专门作用于D体的卤代。