ハロ酸分解性微生物酵素の構造機能相関の解析、環境浄化への応用

卤酸降解微生物酶的构效关系分析及其在环境净化中的应用

基本信息

批准号：
07263233
负责人：
左右田健次
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

L-2-ハロ酸のD-2-ヒドロキシ酸への加水分解反応を解媒するL-2-ハロ酸デハロゲナーゼの反応機構を解析した。ヒドロキシルアミン存在下、基質とインキュベートすると酵素は失活した。クロロ酢酸の存在下で失活した酵素の分子量は失活前に比べて約74増加していた。失活酵素ではAsp10が修飾されていることがN-末端アミノ酸配列分析から明らかになった。失活酵素をリシルエンドペプキダーゼで切断し、Asp10を含むペプチド断片をタンデムMS/MS法で分析したところ、Asp10に対応する部位で73の分子量増加が認められた。L-2-クロロプロピオン酸存在下で失活した酵素では、87の分子量がみられた。観察された分子量増加はAsp10のアスパラギン酸β-ヒドロキシム酸カルボキシルアルキルエステル残基への置換で説明できる。ここにはAsp10、基質、ヒドロキシアミンの3者に由来する部分が含まれており、本酵素反応がAsp10と基質からなるエステル中間体を経由して進行することを示している。X線結晶構造解析の結果、Asp10の近傍にThr14、Arg41、Ser118、Lys151、Tyr157、Ser175、Asn177、Asp180などが存在することが明らかとなった。これらの改変によって、本酵素の機能を改変できるものと期待される。2-ハロ酸のD、L-両異性体に作用するDL-2-ハロ酸デハロゲナーゼ(立体反転型)を用い、D-またはL-2-クロロプロピオン酸を基質としてH^<18>_2O中で反応を行った後、酵素をリシルエンドペプチダーゼまたはトリプシンで分解し、得られたペプチド断片をLC/MS法で分析したが、本酵素への^<18>Oの取り込みは見られなかった。本酵素反応ではエステル中間体は形成されず、溶媒の水分子が直接基質を攻撃して加水分解が起こるものと考えられる。

分析了L-2-卤酸脱卤酶催化L-2-卤酸水解为D-2-羟基酸的反应机理。当在羟胺存在下与底物一起孵育时，酶被灭活。在氯乙酸存在下失活的酶的分子量与失活前相比增加了约74%。 N端氨基酸序列分析表明，失活酶中的Asp10被修饰。当用赖氨酰内肽酶切割灭活的酶并通过串联MS/MS分析含有Asp10的肽片段时，在与Asp10对应的位点处观察到分子量增加了73。在 L-2-氯丙酸存在下失活的酶的分子量为 87。观察到的分子量增加可以通过天冬氨酸 β-羟基酸羧基烷基酯残基取代 Asp10 来解释。该酶含有源自 Asp10、底物和羟胺的部分，表明酶促反应通过由 Asp10 和底物组成的酯中间体进行。 X射线晶体结构分析的结果表明，在Asp10附近存在Thr14、Arg41、Ser118、Lys151、Tyr157、Ser175、Asn177、Asp180等。预期这种酶的功能可以通过这些修饰而改变。使用作用于2-卤代酸的D和L-异构体的DL-2-卤代酸脱卤酶(立体反转型)，D-或L-2-氯丙酸用作与H^ 18 _2O反应的底物。此后，用赖氨酰内肽酶或胰蛋白酶消化酶，并通过LC/MS分析所得肽片段，但没有观察到^ 18 O掺入酶中。在该酶促反应中，没有形成酯中间体，并且认为溶剂中的水分子直接攻击底物，导致水解。