ハロ酸分解性微生物酵素の構造機能相関の解析、環境浄化への応用

卤酸降解微生物酶的构效关系分析及其在环境净化中的应用

基本信息

批准号：
07263233
负责人：
左右田健次
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

L-2-ハロ酸のD-2-ヒドロキシ酸への加水分解反応を解媒するL-2-ハロ酸デハロゲナーゼの反応機構を解析した。ヒドロキシルアミン存在下、基質とインキュベートすると酵素は失活した。クロロ酢酸の存在下で失活した酵素の分子量は失活前に比べて約74増加していた。失活酵素ではAsp10が修飾されていることがN-末端アミノ酸配列分析から明らかになった。失活酵素をリシルエンドペプキダーゼで切断し、Asp10を含むペプチド断片をタンデムMS/MS法で分析したところ、Asp10に対応する部位で73の分子量増加が認められた。L-2-クロロプロピオン酸存在下で失活した酵素では、87の分子量がみられた。観察された分子量増加はAsp10のアスパラギン酸β-ヒドロキシム酸カルボキシルアルキルエステル残基への置換で説明できる。ここにはAsp10、基質、ヒドロキシアミンの3者に由来する部分が含まれており、本酵素反応がAsp10と基質からなるエステル中間体を経由して進行することを示している。X線結晶構造解析の結果、Asp10の近傍にThr14、Arg41、Ser118、Lys151、Tyr157、Ser175、Asn177、Asp180などが存在することが明らかとなった。これらの改変によって、本酵素の機能を改変できるものと期待される。2-ハロ酸のD、L-両異性体に作用するDL-2-ハロ酸デハロゲナーゼ(立体反転型)を用い、D-またはL-2-クロロプロピオン酸を基質としてH^<18>_2O中で反応を行った後、酵素をリシルエンドペプチダーゼまたはトリプシンで分解し、得られたペプチド断片をLC/MS法で分析したが、本酵素への^<18>Oの取り込みは見られなかった。本酵素反応ではエステル中間体は形成されず、溶媒の水分子が直接基質を攻撃して加水分解が起こるものと考えられる。

分析了L-2-半酸脱核酶的反应机制，该乙酰酶介导L-2-六酸的水解反应至D-2-羟基酸。在羟胺存在下与底物孵育后，将酶灭活。与之前失活相比，在存在氯乙酸的情况下摄入的酶的分子量增加了约74。 N末端氨基酸序列分析表明，ASP10在灭活酶中已改变。将灭活酶裂解用赖氨酰内pepquidase裂解，并通过串联MS/MS方法分析含有ASP10的肽片段，并在与ASP10相对应的位点观察到分子量增加73。在存在L-2-氯丙酸的情况下淬灭的酶显示分子量为87。观察到的分子量增加可以通过用ASP10用羧基烷基天际氨基烷基β-羟基羟基物质来解释。这包含源自三个部分的部分：ASP10，底物和羟基胺，表明该酶反应通过由ASP10和底物组成的酯中间体进行。 X射线晶体结构分析表明，Thr14，Arg41，Ser118，Lys151，Tyr157，Ser175，ASN177，ASP180和其他ASP10附近存在。预计这些修饰将允许改变该酶的功能。使用作用于2-六六酸的D和L异构体的DL-2-HALOACID脱核酶（定型形式），使用D- _2O在H^<18> _2O中进行反应，使用D- _2O使用D-或L-氯丙酸作为副酸盐，并通过副酶通过lyysyl odpersy syperdase或Trypspase deperpase deperpase deperpase deperpase depspase ofterpase进行，并将其反应。 LC/MS方法，但未观察到 ^<18> O的掺入酶。人们认为，酯中间体未在该酶反应中形成，并且溶剂中的水分子直接攻击底物，从而导致水解。