ハロ酸分解系酵素の遺伝子工学的解析と応用

卤酸降解酶的基因工程分析及应用

基本信息

批准号：
05278231
负责人：
左右田健次
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

2-ハロ酸の加水分解的脱ハロゲンを解媒する2-ハロ酸デハロゲナーゼ(DEX)の構造と機能を解析した。1.土壌細菌Pseudomonas sp.YLから耐熱性L-DEX(2-ハロ酸のL体に特異的に作用し、D-2-ヒドロキシ酸を与える)を精製し、これが炭酸鎖長2から16の種々の基質に作用することを明らかにした。2.L-DEX遺伝子の塩基配列を決定し、これが、他生物由来のL-DEX及びハロ酢酸デハロゲナーゼと38-57%の高い相同性を示すこと、また、立体特異性を異にするD-DEXや、基質特異性を異にするハロアルカンデハロゲナーゼとは有意な相同性がないことを明らかにした。Pseudomonas sp.113のDL-DEX(2-ハロ酸のDL両異性体に作用し、立体反転で2-ヒドロキシ酸を与える)の遺伝子のクローン化にも成功し、現在構造解析を行っている。3.クローン化したL-DEX遺伝子を、Escherichia coliJM109に導入し、L-DEXが全可溶蛋白質の約50%を占める高発現株を取得した。この組換え体から、熱処理とイオン交換クロマトグラフィーのみで簡便に本酵素を均一に精製する方法を確立した。4.3.で大量に精製した酵素を用い、良質な単斜晶系の結晶を得ることができた。X線回折データを収集し、現在、解析を行っている。5.L-DEXはAsp,Glu,Arg,Tyrの化学修飾で失活した。他生物由来のL-DEXとの間で完全に保存されているAsp,Glu,Arg,Tyrを部位特異的変異法により、Asn,Glu,Lys,Pheにそれぞれ改変した。その結果、10位及び180位のAsp残基、41位のArg残基、157位のTyr残基を改変した変異酵素において著しい活性低下が認められ、これらの触媒反応への関与が示唆された。

介导2-半酸的水解去催化性的2-卤代酸脱核酶（DEX）的结构和功能。 1。耐热l-dex（特异性作用于2-半酸的L形式并给出D-2-羟基酸）是从土壤细菌中纯化的。与其他生物体的L-DEX和卤乙酸脱核酶，并且与D-DEX没有明显的同源性，而D-DEX的立体特异性有所不同，或者在底物特异性方面有所不同。它也已成功克隆了假单胞菌SP.113的基因（作用于2-六六六酸的DL异构体，并通过立体鉴定产生2-羟基酸），目前正在结构分析中。 3。将克隆的L-dex基因引入了Colijm109中，并获得了高度表达的菌株，L-DEX约占总可溶性蛋白的50％。通过热处理和离子交换色谱法建立了一种从该重组统一纯化酶的方法。使用在4.3中大量纯化的酶，获得了高质量的单斜晶体。收集X射线衍射数据并目前正在分析。 5。L-DEX通过ASP，Glu，Arg和Tyr的化学修饰而停用。通过位于位置的突变将ASP，Glu，Arg和Tyr完全保守的ASN，GLU，LYS和PHE，完全保存为ASN，Glu，Lys和Phe。结果，在突变酶中观察到了显着降低活性，这些突变酶改变了位置10和180的ASP残基，位置41的ARG残基，而位置为157的Tyr残基，这表明它们参与催化反应。