制御機能をもつ耐熱性酵素の設計と応用

具有调控功能的耐热酶的设计及应用

基本信息

批准号：
04205071
负责人：
左右田健次
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至 1992
项目状态：
已结题

项目摘要

耐熱性酵は単に熱安定性に優れているだけではなく、プロテアーゼによる分解などの生物的な作用も受けにくいことから、センサーやバイオリアクターにおける安定な機能素子として利用されている。われわれは、基質特異性は異なるが同種の反応を触媒する、アラニン、ロイシン、フェニルアラニンの各脱水素刻素を種々の好熱菌より単離し、それぞれの一次構造を決定するとともに、これまでに立体構造が決定された各種のNAD(P)依存脱水素酵素との構造比較から、これら3種のアミノ素脱水素酵素には、NAD(P)を結合し、ヒドリドイオンを転移し、酸化還元反応を行う場である触媒性ドメインと、アミノ酸の構造を認識し、これを結合して反応を行う基質結合ドメインの2つの部分から構成されることを示した。このうち後者については、基質認識を行っているいわば調節性のドメインとして機能していることを明らかにした。耐熱性酵素の各ドメインは常温菌由来の酵素のそれに比べて機能的、構造的に強い狭立性を持っていること、さらに、耐熱性酵素においては、各ドメインの独立性が高いため、調節性ドメインに何らかの修飾を加えてもヒドリドイオンの転移という酵素の触媒作用には障害を与えないことを想定し、耐熱性ロイシン脱水素酵素の機能性ドメインにフェニルアラニン脱水素酵の調節性ドメインを結合したキメラタンパク質を作成し、ロイシン脱水素酵素からフェニルアラニン脱水素酵素への変換の有無を検討し、このドメインの構造と機能と関連を検討した。これら一連の研究によって、耐熱声酵素の各ドメインをタンパク質工学の手法を用いて改変し、入れ換えることによって、複合的な機能を持つ素子としての新しい耐熱性酵素を作出できることをはじめて実証した。

耐热发酵不仅在热稳定性方面非常出色，而且较小的可能受到诸如蛋白酶分解之类的生物学作用的可能性，因此被用作传感器和生物反应器中的稳定功能元件。我们分离了丙氨酸，亮氨酸和苯丙氨酸的脱氢作用，它们从不同的底物特异性中催化了相同的反应，来自各种嗜热细菌，并确定了它们的主要结构，并比较了它们的主要结构，并比较了各种NAD（P）依赖性脱氢酶的结构，这些结构已被两种结构均与较远的结合确定了，这表明了两种疾病的结合。 NAD（P），转移氢化物离子并执行氧化还原反应，以及识别氨基酸结构并结合它们以执行反应的底物结合结构域。这些功能是执行底物识别的调节域。 Each domain of a thermo-resistant enzyme has a functional and structurally stronger narrowness than that of an enzyme derived from a room temperature bacteria, and furthermore, in heat-resistant enzymes, the independence of each domain, so even if some modification is made to the regulatory domain, it will not impair the catalytic action of the enzyme, such as hydrido ion transfer, and chimeric创建了蛋白质，其中耐热亮氨酸脱氢酶的功能结构域与苯丙氨酸脱氢酶的调节结构域结合，以及是否检查了亮氨酸脱氢酶对苯丙氨酸脱氢酶的转化，检查了该域名的结构，功能和功能和关系。这些系列研究首次证明，通过使用蛋白质工程技术修改和替换耐热声酶的每个结构域，可以作为具有复杂功能的设备生产新的耐热酶。