分断型アラニンラセマーゼの分子構造形成における細胞内マトリツクスの相互作用

丙氨酸消旋酶碎片分子结构形成中的细胞内基质相互作用

基本信息

批准号：
07229229
负责人：
左右田健次
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至 1995
项目状态：
已结题

项目摘要

好熱菌由来のアラニンラセマーゼのサブユニットは、2次構造予測から2つのドメインよりなるものと推測される。両ドメインを遺伝子工学的に別々に発現させた場合、補酵素PLPを結合部位を含む、N-末端ドメインタンパク質(N-フラグメント)がinclusion bodyを形成して宿主大腸菌の不溶性の画分に回収されたのに対して、C-フラグメントは発現しなかった。しかし両者を異なるベクター上で共発現させた場合には、α2β2構造を持ち、野生型酵素の約50%の活性を示す分断型酵素が得られた。また大腸菌由来の分子シャペロンであるgroESLを共発現させた場合にはN-フラグメントは宿主E. coliの可溶性画分にえられ、ラセマーゼ活性を示した。またin vitroにおける変性N-フラグメントのリフォルディングを検討したところ、C-フラグメントまたはシャペロンGroESLとともにリフォルディングさせた場合のみラセマーゼ活性を示した。以上の結果はアラニンラセマーゼにおいてはN-末端ドメインがその活性発現に関与し、C-末端ドメインは酵素のフォルディングを助けるいわば分子内シャペロンとして働いていることを意味する。X線解析による立体構造解析の結果では、本酵素のサブユニットは大小2つのドメインから形成されるが、そのヒンジ部分の位置は予想されたドメイン領域より20残基程度N-末端側に位置した。予想されたN-末端ドメインはα,β-バレル構造をもつコアの部分と一対の逆平行β構造をもつ領域からなり、補酵素PLPはα, β-バレル構造の中心に位置している。C-末端ドメインはN-末端ドメインの突きだした部分に巻き付くように存在する。PLPを中心とする活性部位近傍には、C-末端ドメインに属する残基はほとんど存在せず、N-末端ドメインがラセマーゼの活性発現に関与するという本研究で結果を支持した。

据估计，基于二级结构预测的两个结构域，来自嗜热细菌的丙氨酸种族酶的亚基由两个结构域组成。当两个结构域分别表达了基因设计时，含有结合位点的N末端结构域蛋白（N-FRAGMENT）形成了包含体，并以宿主大肠杆菌的不溶性分数恢复，而C-fragment却没有表达C rag。但是，当两者在不同的载体上共表达时，获得了具有α2β2结构的分裂酶，并获得了野生型酶的约50％活性。此外，当共表达groESL时，源自大肠杆菌的分子伴侣时，将N碎片添加到宿主大肠杆菌的可溶性部分中，显示出种族主义的活性。此外，研究体外的变性N-碎片碎片的重折叠时，仅在与C-Fragment或Chaperone groesl重折叠时显示了种族酶活性。以上结果表明，在丙氨酸种族主义酶中，N末端结构域参与其活性表达，并且C末端结构域充当分子内伴侣蛋白，可以说，可以帮助酶的折叠。根据X射线结构分析的结果，尽管该酶的亚基是由大小的两个结构域形成的，但铰链部分位于预测域区域的N末端约20个残基。预测的N末端结构域由具有α，β-桶结构的核心部分和带有一对反平行β结构的区域，辅酶PLP位于α，β-桶结构的中心。 C末端结构域以某种方式围绕着N末端域的突出部分包裹。在这项研究中支持了结果，几乎没有属于PLP的活性位点附近的C末端结构域的残基，并且N末端结构域参与了种族酶的活性表达。