2-ハロ酸デハロゲナーゼの構造と反応機構の解析、それに基づく酵素機能の改変

2-卤酸脱卤酶的结构和反应机制分析，并在此基础上对酶功能进行修饰

基本信息

批准号：
07780535
负责人：
栗原達夫
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

L-2-ハロ酸のD-2-ヒドロキシ酸への加水分解を触媒するL-2-ハロ酸デハロゲナーゼと、2-ハロ酸のD-、L-両異性体に作用し、L-、D-2-ヒドロキシ酸を与えるDL-2-ハロ酸デハロゲナーゼ(立体反転型)の構造と反応機構を解析した。L-2-ハロ酸デハロゲナーゼを用い、1分子の酵素が1回だけ反応を触媒するSingle Turnoverの反応と、1分子の酵素が複数回反応を触媒するMultiple Turnoverの反応をH_2^<18>O中で行い、生成物2-ヒドロキシ酸への^<18>Oの取り込みの有無を調べた。L-2-クロロプロピオン酸を基質としたところ、生成物乳酸への^<18>Oの取り込みはMultiple Turnoverの反応でのみ認められた。これは、溶媒の水分子の酸素原子が、いったん酵素に取り込まれた後、基質に取り込まれたことを示唆している。H_2^<18>O中で反応を行った酵素をプロテアーゼで分解し,得られたペプチド断片をタンデムMS/MS法で分析した結果、Asp10への^<18>Oの取り込みが明らかとなった。本酵素反応では、Asp10の側鎖カルボキシ基が基質のα-炭素を攻撃してハライドイオンが脱離し、次いで、酵素と基質からなるエステル中間体が加水分解されて2-ヒドロキシ酸が遊離するものと考えられた。一方、DL-2-ハロ酸デハロゲナーゼ(立体反転型)を用い、D-またはL-2-クロロプロピオン酸を基質としてH_2^<18>O中で反応を行ったところ、1分子の酵素が1回だけ反応を触媒するSingle Turnoverの反応でも、1分子の酵素が複数回反応を触媒するMultiple Turnoverの反応でも生成物乳酸への^<18>Oの取り込みが認められた。本酵素反応では、溶媒の水分子が直接基質を攻撃して加水分解が起こるものと考えられた。

L-2-卤酸脱卤酶催化L-2-卤酸水解为D-2-羟基酸，同时作用于2-卤酸的D-和L-异构体，L-和D结构与反应分析了产生-2-羟基酸的DL-2-卤酸脱卤酶（空间反转型）的机制。使用L-2-卤酸脱卤酶，利用H_2^ 18 O的存在进行一分子酶仅催化反应一次的单周转反应和一分子酶催化反应多次的多周转反应。研究了产物2-羟基酸中是否没有引入18 O。当L-2-氯丙酸用作底物时，仅在多次周转反应中观察到18 O掺入产物乳酸中。这表明溶剂中水分子的氧原子曾经掺入酶中，然后掺入底物中。用蛋白酶消化在H_2^ 18 O中反应的酶，并通过串联MS/MS分析所得肽片段，其揭示了^ 18 O掺入Asp10中。在该酶促反应中，Asp10的侧链羧基攻击底物的α-碳以消除卤离子，然后由酶和底物组成的酯中间体被水解，释放2-羟基酸。另一方面，当使用DL-2-卤酸脱卤酶(立体反转型)在H_2^ 18 O中使用D-或L-2-氯丙酸作为底物进行反应时，酶的一个分子是在单周转反应(其中反应仅被催化一次)和多周转反应(其中一分子酶催化反应多次)中均观察到^ 18 O掺入产物乳酸中。在这种酶促反应中，溶剂中的水分子被认为直接攻击底物，导致水解。