細菌の多機能デハロゲナーゼを用いるダイオキシン分解系の開発

利用细菌多功能脱卤酶开发二恶英分解系统

• 批准号: 10876019
• 负责人: 江崎 信芳
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10876019/
• 关键词: フルオロ酢酸デハロゲナーゼ; Burkholderia属細菌; ハロ酢酸; L-2-ハロ酸デハロゲナーゼ; 2-ハロ酸; 酵素基質複合体; 結晶構造解析

高い結合エネルギーを有する炭素-フッ素結合を切断する新規酵素の単離に成功した。フルオロ酢酸を唯一の炭素源とするバッチ集積培養により、京都府宇治市の土壌からデハロゲナーゼ生産菌を取得した。16SrDNAの塩基配列から、本菌はBurkholderia属細菌であることが明らかとなり、Burkholderia sp.FA1と命名した。本菌体抽出液から、硫安分画、Butyl-Toyopearlクロマトグラフィー、DEAE-Toyopearlクロマトグラフィーによって、比活性にして約130倍にデハロゲナーゼを精製し、電気泳動的にほぼ均一な標品を得た。サブユニット分子量は約34,000、ネイティブ酵素の分子量は約79,000であったことから、本酵素は二重体として存在するものと考えられた。精製酵素は、フルオロ酢酸、クロロ酢酸、ブロモ酢酸に作用し、ハライドイオンの脱離を触媒したが、フルオロ酢酸に対する活性が最も高かった。フルオロ酢酸に対する活性は、クロロ酢酸に対する活性の約26倍、ブロモ酢酸に対する活性の約29倍であった。ジフルオロ酢酸、トリフルオロ酢酸、2-クロロプロピオン酸は本酵素の基質にはならなかった。フルオロ酢酸を基質としたときの至適pHは約9.5、Vmax値は11μmol.min^<-1>.mg^<-1>、Km値は5.1mMであった。本酵素は、難分解性の有機フッ素化合物の分解に有用であると考えられる。

成功隔离新酶，该酶以高结合能切断了碳氟键。使用氟乙酸作为唯一的碳源，是从京都县Uji City的土壤中获得的。 16srDNA的基础序列表明该细菌是Burkholderia属，被称为Burkholderia sp.fa1。从细菌提取物中，硫形，丁羟基色谱和Deae-Toyopearl色谱法已被纯化约130倍，作为比例活性，并获得了电泳的游泳项目。由于亚基分子量约为34,000，而天然酶的分子量约为79,000，因此该酶被认为是双体体。纯化的酶作用于氟乙酸，氯乙酸和溴乙酸，并且已经催化了哈里德离子的催化剂，但对氟乙酸的活性最高。氟乙酸的活性约为氯乙酸活性的26倍，约为溴乙酸活性的29倍。差异乙酸，三氟乙酸和2-氯丙酸丙酸未成为该酶的底物。当用作底物的最佳pH值约为9.5时，VMAX值为11μmol.min^<-1> .mg^<-1>，km值为5.1 mm。该酶被认为可用于分解难度溶解有机氟化合物。

项目成果

Ji-Quan Liu et al.: "Reaction mechanism of fluoroacetate dehalogenase from Moraxella sp.B." Journal of Biological Chemistry. 273・47. 30897-30902 (1998)

Ji-Quan Liu 等：“Moraxella sp.B. 的氟乙酸脱卤酶的反应机制”，《生物化学杂志》273・47（1998）。

Vincenzo Nardi-Dei et al.: "DL-2-Haloacid dehalogenase from Pseu domonas sp.113 is a new class of dehalogenase catalyzing hydrolytic dehalogenation not involving enzyme-substrate ester intermediate"The Journal of Biological Chemistry. 273(30). 20977-20981

Vincenzo Nardi-Dei 等人：“来自 Pseu domonas sp.113 的 DL-2-Haloacid 脱卤酶是一类新的脱卤酶，催化水解脱卤，不涉及酶-底物酯中间体”《生物化学杂志》。