培養神経細胞を用いたシナプス再形成・機能修復実験系の開発と分子機構解明

利用培养神经元开发突触再生和功能修复实验系统并阐明分子机制

基本信息

批准号：
09280235
负责人：
黒田洋一郎
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Institute for Neuroscience
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、リハビリテーションによる機能修復の背景にある、活動依存性と考えられるシナプス再形成に必須の分子カスケードを、活動依存的に放出されるATPを利用した機能分子のエクトプロテインキナーゼによるリン酸化に焦点を絞って研究した。細胞膜を透過しないプロテインキナーゼ阻害剤・K-252bを、ラット大脳皮質培養細胞の培養上清に添加したところ、ニューロンからの突起伸展には影響なしに、形成されるシナプス数が著しく減少した。同時にK-252bの存在下では、細胞外で生じていると考えられる蛋白質リン酸化反応も阻害され、基質となる膜蛋白質の細胞外ドメインのエクトプロテインキナーゼによるリン酸化が、ニューロン間のシナプス形成において重要な役割を果たしていると考えられた。このリン酸化反応の基質蛋白質の一つとして、シナプトフォスカン(MAP1B)を同定し、さらにこの分子が大きな細胞外ドメインをもつ膜蛋白質である証拠も得られた。マウスペクトロメトリーを用いてリン酸化部位を解析したところ、アミノ酸配列上に30以上のリン酸化部位が同定され、その多くはプロリン指向性プロテインキナーゼによるものだった。また、発生段階を追って各リン酸化部位を調べたところ、シナプス形成終了前後にあたる生後1週から2週目頃に、特異的に脱リン酸化される部位が、ヘプタデカリピートという特徴的なドメインにおいて2ヶ所のみ見出された。シナプス結合の形成そのものに膜蛋白質のリン酸化・脱リン酸化が関わっていることが示唆された。一方、ニューロン内での局在や細胞膜とのトポロジーを特異的な抗体を用いて光学顕微鏡レベルで調べたところ、シナプトフォスカン(MAP1B)が樹状突起の細胞膜に沿って分布している像が得られた。さらに電子顕微鏡で観察すると、この蛋白は細胞体や樹状突起以外にも、大脳皮質中の約半数のシナプスでのみ、後シナプス肥厚部に局在していた。シナプトフォスカン(MAP1B)の細胞外ドメインのリン酸化が皮質ニューロン間のシナプス再形成にも関与している可能性がより詳細に明らかになった。

今年，专注于使用功能分子的磷酸化，这些功能分子使用的ATP可以减轻活性，这对于突触重新形成至关重要，这被认为取决于活动，这被认为是依赖活性的，这被认为是依赖活动。当不传输细胞膜的K-252b被添加到大鼠脑皮质培养细胞的培养物上清液中时，形成的突触数量大大减少而没有对投射并从神经元伸展的影响。同时，在存在K-252b的情况下，也抑制了被认为是细胞的蛋白磷酸化反应，并且通过底物细胞外域的八蛋白酶的磷酸化，这是底物，这是底物的磷酸化酶，是神经元之间的突触形成。作为该磷酸化反应的底物蛋白之一，鉴定出Sinapto Phoscan（MAP1B），并获得了证据证明该分子是具有较大细胞外域的膜蛋白。当使用透度法分析磷酸化位点时，在氨基酸序列上鉴定出30多个磷酸化的位点，许多磷酸化位点是由面向脯氨酸的突出引起的。此外，当每个磷酸化位点在发生阶段进行检查时，在出生后的第一周，特异性挖掘的部分与突触形成的结束相对应，是一个称为七生的特征域。成立。有人提出，膜蛋白本身的磷酸化和磷酸化参与突触键本身的形成。另一方面，当使用特定的抗体在光学显微镜水平上检查了局部区域和拓扑结构，沿兽医投射的细胞膜分布知道了。此外，当使用电子显微镜观察时，该蛋白质位于大脑皮层中约一半突触的后突触增厚部分，除了细胞和树突状突显。更详细的是，Sinapto Phoscan（MAP1B）细胞外结构域的磷氧化可能与皮质神经元之间的突触重新形成有关。