培養神経細胞を用いたシナプス再形成・機能修復実験系の分子機構解明

利用培养神经元阐明突触再生和功能修复实验系统的分子机制

基本信息

批准号：
11157233
负责人：
黒田洋一郎
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

神経細胞死に関連したシナプスの脱落は、神経系の機能障害を理解する上で重要であり、脱落後のシナプス再形成機構の解析は、神経機能の修復すなわち治療への応用にも意義があると考えられる。この機能回復の実態を細胞・分子レベルで明らかにするために、大脳皮質などの中枢培養神経細胞を用いた実験系、ことに培養系でのシナプスの脱落と再形成を可視化して観察するシステムについて検討した。シナプスの変化を可視化する解析法として、シナプスに局在するマーカー蛋白質に対する抗体を用いた免疫細胞染色を行い、共焦点レーザー走査顕微鏡観察と高精細3次元画像構築ソフト・IMARISなどを用いて、シナプスレベルでの形態的変化の観察を試みた。いずれの抗体によっても、ニューロンの細胞体、樹状突起上などにシナプス様の細かい粒状の染色像が観察され、中枢神経細胞培養系内で、多数のシナプスが成形されていることが可視化できた。用いる抗体により、例えば、興奮性シナプスについては抗NMDA受容体抗体、抑制性シナプスについては、抗GABA_A受容体抗体や抗Glutamic Acid Decarboxylase(GAD)抗体などを用いることにより、興奮性、抑制性のシナプスを個別に観察したり、シナプス前と後シナプスを別々に観察することが可能となった。さらに、三次元構築した共焦点画像を、IMARISを用いて処理加工した。これまでの共焦点レーザー顕微鏡観察でも、ニューロンの細胞体、樹状突起上に分布するシナプスを捉えることができたが、画像解析ソフトを用い、染色像を360度回転させることにより、理論上は、あるニューロンに存在する全てのシナプスが観察可能であり、シナプスの詳細な位置関係や形状なども調べることが可能となった。このシステムを用いることで、培養ニューロン間に形成されたシナプスの形態・数そしてその変化などを、電子顕微鏡を用いるのよりもはるかに簡便かつ詳細に追跡できる可能性がある。さらに、薬剤処理や損傷を与えた後のシナプスの脱落・修復過程を経時的に追跡したり、定量的に評価したりすることも可能であり、応用として、シナプスに障害を与えたり修復を促進するような因子の選別も容易に行えると思われる。

与神经元细胞死亡相关的突触脱落对于理解神经系统功能障碍具有重要意义，分析突触脱落后突触重新形成的机制对于恢复神经功能或将其应用于治疗也具有重要意义。为了在细胞和分子水平上阐明这种功能恢复的现实，我们使用了一个实验系统，该系统使用培养的中枢神经元（例如大脑皮层中的神经元），特别是一个可以可视化和观察突触丢失和重新形成的系统。我们考虑过这一点。作为一种可视化突触变化的分析方法，我们使用针对突触中标记蛋白的抗体进行免疫细胞染色，并使用共焦激光扫描显微镜和高清3D图像构建软件IMARIS来分析突触的形态变化。不同的级别。使用这两种抗体，在神经元的细胞体和树突上观察到突触状的细颗粒染色图像，并且可以可视化中枢神经细胞培养系统中大量突触的形成。根据所使用的抗体，例如，抗NMDA受体抗体用于兴奋性突触，抗GABA_A受体抗体或抗谷氨酸脱羧酶（GAD）抗体用于抑制性突触。现在可以观察突触。单独观察，并分别观察突触前和突触后。此外，使用 IMARIS 处理三维构建的共焦图像。传统的共焦激光显微镜观察已经能够捕获分布在神经元细胞体和树突上的突触，但是通过使用图像分析软件将染色图像旋转360度，理论上，观察到某个神经元中存在的所有突触已经成为可能，并研究突触的详细位置关系和形状。使用该系统，可以比使用电子显微镜更容易、更详细地跟踪培养神经元之间形成的突触的形态、数量和变化。此外，还可以跟踪和定量评估药物治疗或损伤后突触随时间的丢失和修复过程。作为一种应用，可以损伤突触并促进修复，似乎很容易选择这样的因素。。