活性酸素種によるラット培養大脳皮質神経細胞・アストロサイトの細胞死機構の解析

活性氧对培养大鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞死亡机制的分析

• 批准号: 09771543
• 负责人: 田中 康一
• 金额: $ 0.26万
• 依托单位: Kagoshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09771543/
• 关键词: 過酸化水素; チミジン取り込み; アストロサイト; DNA障害; 活性酸素種; リアノジン受容体; IP_3受容体; ディファレンシャルディスプレイ; 活性酵素種; Ca^<2+>

本研究は脳虚血・再灌流障害や老化過程に関与すると考えられるラジカル反応性の高い活性酸素種の作用メカニズムを解明することを目的としている。これまでに、培養神経細胞とアストロサイトを過酸化水素(H_2O_2)で処置すると、DNA傷害を引き起こしながらそれぞれの細胞死が異なった時間及び濃度依存性を示すことを明らかにしてきた。さらに本研究の初年度では、それぞれの細胞にH_2O_2を短時間適用し、DNA傷害修復能を反映するチミジン取り込みのメカニズムについて薬理学的手法を用いて検討し、次の結果を得てきた。H_2O_2は神経細胞ではなくアストロサイトにおいて、ウリジンではなくチミジンの取り込みを促進した。H_2O_2によるアストロサイトのチミジン取り込みの促進効果は、細胞外液と細胞内Ca^<2+>貯蔵部位からのCa^<2+>の細胞質への流入に依存し、細胞内Ca^<2+>キレーターであるBAPTA-AMによって完全に抑制されることから細胞内遊離Ca^<2+>の存在を必要とした。さらに、H_2O_2短時間処置時に細胞内遊離Ca^<2+>が存在しないと、その後の細胞死が促進された。また、同処置によりDNAの断片化が観察され、H_2O_2は細胞内遊離Ca^<2+>依存的にアポトーシス様の細胞死を引き起こした。そこで本研究の2年目においては、H_2O_2によるアストロサイトのチミジン取り込みとその後の細胞死やDNAの断片化に対する細胞内Ca^<2+>貯蔵部位の詳細を検討し、リアノジン受容体、及び、IP_3受容体の活性化がこれらを促進することを明らかにした。さらに、チロシンキナーゼ情報伝達系もこれらに対して影響を及ぼすことを明らかにした。また、H_2O_2によるアストロサイトにおける障害や回復に関与する可能性のある蛋白質発現をディファレンシャル・ディスプレイ法により遺伝子レベルで検討したところ、いくつかの差異遺伝子を検出した。これらの差異遺伝子が発現量に差があるmRNAに由来するのかを現在確認するとともに、これらの遺伝子がどのような役割を果たしているのかについて、シーケンシングやノーザンプロットなどを行い検討することとしている。

这项研究旨在阐明高度根治性活性活性氧的作用机理，这被认为与脑缺血，再灌注损伤和衰老过程有关。迄今为止，已经表明，用过氧化氢（H_2O_2）对培养的神经元和星形胶质细胞的处理表现出每个细胞死亡的时间和浓度依赖性不同，同时导致DNA损伤。此外，在这项研究的第一年中，使用药理技术检查了反映其DNA损伤修复能力的胸苷摄取机制，将H_2O_2应用于每个细胞，并获得了以下结果，并获得了以下结果。 H_2O_2在星形胶质细胞而不是神经元中促进了胸苷而不是尿苷的摄取。 H_2O_2对星形胶质细胞胸苷吸收的效果增强取决于Ca^<2+>从细胞外流体和细胞内Ca^<2+>储存位点涌入细胞质，并且完全抑制了细胞内Ca^<2+> Chelator bapta-capta-am，需要CA的范围，<2+2+<2+<2+<2+<2+<2+<2+<2+<2+<2+<2+<2+<2+。此外，在短期治疗H_2O_2期间，没有细胞内游离CA^<2+>促进了随后的细胞死亡。此外，通过相同的处理观察到DNA碎片，H_2O_2以无细胞的Ca^<2+>依赖性方式引起凋亡样细胞死亡。因此，在这项研究的第二年中，我们研究了H_2O_2的细胞内Ca^<2+>存储位点的储存位点以及随后的细胞死亡和DNA片段化，并揭示了Ryanodine受体和IP_3受体的激活会促进这些。此外，揭示酪氨酸激酶信号系统也对这些信号系统产生影响。此外，当使用鉴别显示方法在基因水平检查了可能参与由H_2O_2引起的星形胶质细胞损伤和恢复的蛋白质的表达时，检测到了几种差异基因。现在，我们将确认这些差异基因是否来自具有不同表达水平的mRNA，还将通过测序和北部绘制来检查这些基因的作用。

项目成果

Tanaka K.: "Hydrogen peroxide-induced thymidine incorporation into cultured rat cerebral astrocytes.(発表予定)" The Japanese Journal of Pharmacology. (1998)

Tanaka K.：“过氧化氢诱导的胸苷掺入培养的大鼠脑星形胶质细胞。（待出版）”日本药理学杂志（1998）。

田中康一: "ラット培養アストロサイトにおける過酸化水素によるチミジン取り込みに対する細胞内Ca^<2+>とプロティンキナーゼCの関与" 歯科基礎医学会雑誌 第40回歯科基礎医学会抄録集. 40・Sup.367 (1998)

田中浩一：“培养大鼠星形胶质细胞中过氧化氢诱导的胸苷摄取中细胞内Ca^2+和蛋白激酶C的参与”第40届日本基础牙科医学会杂志摘要40・。高级.367 (1998)

田中康一: "ラット培養アストロサイトにおける過酸化水素によるチミジン取り込みに対するリアノジン受容体の役割" 神経化学 第41回日本神経化学会(東京)大会抄録号. 37・3. 510 (1998)

田中浩一：“兰尼碱受体对培养的大鼠星形胶质细胞中过氧化氢诱导的胸苷摄取的作用”神经化学第41届日本神经化学学会（东京）会议摘要第37・3.510号（1998年）

田中康一: "ラット培養アストロサイトにおける過酸化水素によるDNA断片化とチミジン取り込みに対するリアノジン受容体の役割" 日本薬理学雑誌 第26回薬物活性シンポジウム. 112・補冊1. 108-112 (1998)

Koichi Tanaka：“兰尼碱受体对培养的大鼠星形胶质细胞中过氧化氢诱导的 DNA 片段化和胸苷摄取的作用”，日本药理学杂志第 26 届药物活性研讨会，增刊 1. 108-112 (1998)。

Tanaka K.: "Hydrogen peroxide-induced thymidine incorporation into cultured rat cerebral astrocytes." The Japanese Journal of Pharmacology. 76・Sup.I. 55 (1998)

Tanaka K.：“过氧化氢诱导的胸苷掺入培养的大鼠脑星形胶质细胞”，《日本药理学杂志》76·Sup.I。