ラット大脳皮質培養細胞を用いたニューロン間のシナプス形成機能の解析

培养大鼠大脑皮层细胞分析神经元间突触形成功能

基本信息

批准号：
10780488
负责人：
村本和世
金额：
$ 0.45万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research (1999)Tokyo Metropolitan Institute for Neuroscience (1998)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

我々はこれまでに、ラット大脳皮質初代培養細胞系を用いて、ニューロン間のシナプス形成過程に関する研究を続けてきた。シナプス形成の解析法として、培養ニューロンの自発的神経活動をカルシウムイメージング法を用いてモニターしたり、電子顕微鏡を用いた観察などを用いてきたが、前者は確実性・定量性などで若干の問題があり、後者は利便性に難点があった。本年度は、大脳皮質や副嗅球など中枢培養神経細胞を用いた実験系、ことに培養系でのシナプスの形成や脱落を可視化して観察する新しいシステムについて検討した。シナプスに局在するマーカー蛋白質に対する抗体を用いた免疫細胞染色を行い、共焦点レーザー走査顕微鏡観察と高精細3次元画像構築ソフト・IMARISなどを用いて、シナプスレベルでの形態的変化の観察を試みた。いずれの抗体によっても、ニューロンの細胞体、樹状突起上などに、シナプス様の細かい粒状の染色像が観察され、中枢神経細胞培養系内で、多数のシナプスが形成されていることが可視化できた。用いる抗体により、例えば、興奮性シナプスについては抗NMDA受容体抗体、抑制性シナプスについては抗GABA_A受容体抗体や抗Glutamic Acid Decarboxylase(GAD)抗体などを用いることにより、興奮性、抑制性のシナプスを分けて観察したり、シナプス前と後シナプスを別々に観察することが可能となった。さらに、三次元構築した共焦点画像を、IMARISを用いて処理加工した。これまでの共焦点レーザー顕微鏡観察でも、ニューロンの細胞体、樹状突起上に分布するシナプスを捉えることができたが、画像解析ソフトを用い、染色像を360度回転させることにより、理論上はあるニューロンに存在する全てのシナプスが観察可能であり、シナプスの詳細な位置関係や形状なども調べることができるのである。このシステムを用いることで、培養ニューロン間に形成されたシナプスの形態・数そしてその変化などを、電子顕微鏡を用いるのよりもはるかに簡便かつ詳細に追跡できる可能性がある。さらに、薬剤処理や損傷を与えた後のシナプスの変化を経時的に追跡したり、定量的に評価したりすることも可能であり、応用として、シナプス形成を促進するような因子の選別も容易に行なえると思われる。

到目前为止，我们一直在研究使用大鼠脑皮质的第一个代代培养细胞系统之间神经元之间的污染形成过程。作为突触形成的分析，已经使用钙成像法对培养神经元的自愿性神经活性进行了监测，并且使用了电子显微镜观察，但前者有一个细微的问题，具有确定性和定量性方便方面的困难。今年，我们使用中央培养神经细胞（例如脑皮质和牺牲球体）检查了一个实验系统，以及一个新的系统，该系统可视化培养系统中突触和辍学的形成。使用用于突触中的标记蛋白的抗体进行免疫细胞染色，焦点激光扫描显微镜观察和高定义3D图像构建软件，Imaris等，以尝试在突触水平上观察形态变化。在两种抗体中，在神经元的细胞和跨核突出中都观察到突触的细颗粒染色图像，并且可以看到许多突触在中央神经细胞培养系统中形成。取决于使用的抗体，例如用于兴奋突触的抗-NMDA受体抗体，抗-gaba_a受体抗体和抗谷氨酸脱羧酶（GAD）抗体（GAD）抗体（GAD）抗体可用于观察抗体。分别观察突触突触。此外，使用iMaris处理了三维构建的CO-焦点图像。在先前的焦点激光显微镜观察中，可以捕获分布在神经元细胞和树突式突起上的突触，但是通过使用图像分析软件并将染色图像旋转360度。，可以检查突触的详细位置关系和形状。通过使用该系统，与使用电子显微镜相比，它可能更简单，更详细地以形式，数字和变化的培养神经元之间形成的突触。此外，可以跟踪和定量评估药物治疗和损害后突触的变化，并且很容易选择促进突触形成的因素。