巨大ヒトゲノム導入による機能解析

引入巨型人类基因组进行功能分析

基本信息

批准号：
09272218
负责人：
和田守正
金额：
$ 2.43万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒトMDR遺伝子領域をモデルクローンに用いて、導入YACの動態、導入効率を解析し、YAC導入法の再現性を規定しうる因子は何かを検討するとともに、YAC導入法を応用して、実際に発現クローニングを試みた。その結果、1.MDR1のcDNAを用いた導入実験によると、薬剤耐性トランスフェクタント/Neo^rトランスフェクタントの効率は0.06%である。これに対し、YACクローンを用いた場合、Neo^rトランスフェクタント全てが耐性を獲得していることを示し、cDNAを用いた場合に見られる挿入位置による発現量の不均一性を回避できることを示唆した。2.導入YACの動態の解析、5aza-CdR処理実験により、この挿入位置非依存的発現は、導入DNAのメチル化からの回避によることを明らかにした。3.このYAC導入法を発現クローニングに応用して、新規耐性関連遺伝子の探索を試みた。MDR1周辺の300kb及び850kbYACの導入細胞につき、MDR1遺伝子産物と薬剤感受性の相関を検討した結果、この領域の新規耐性関連遺伝子の存在が示唆された。さらに、エクソントラップ法によりこの領域の60エクソンを単離した。このうち膜タンパク質をコードする遺伝子が6種類存在し、薬剤トランスポータとして薬剤感受性に関与していることが示唆された。以上の成果からYAC導入による発現系の有用性が示されたが、発現クローニングへ応用するためには導入効率を改善し、挿入位置非依存的発現の一般性を検討する必要がある。従って、従来の成果をさらに発展させ広範なシステムに効率よく適用させるために、今後1.YACを環状化した後導入する方法を開発して、YAC導入時の専断力を避け、効率を上昇させる、2.メチル化による導入遺伝子の選択的発現の一般性を他の遺伝子クローンについて検討する、ことなどが必要であると考えられる。

以人MDR基因区域为模型克隆，分析了YAC导入的动力学和导入效率，考察了决定YAC导入方法重现性的因素，并尝试应用YAC导入方法进行实际研究。表达克隆。结果，根据使用1.MDR1 cDNA的导入实验，耐药转染子/Neo^r转染子的效率为0.06％。另一方面，当使用YAC克隆时，所有Neo^r转染子都获得了抗性，这表明可以避免使用cDNA时出现的由于插入位置引起的表达水平的异质性。 2.对引入的YAC和5aza-CdR处理实验的动力学分析表明，这种插入位点无关的表达是由于避免了引入的DNA的甲基化。 3.我们试图通过将这种YAC导入方法应用于表达克隆来寻找新的抗性相关基因。在 MDR1 周围引入 300kb 和 850kb YAC 的细胞中，对 MDR1 基因产物与药物敏感性之间的相关性进行检查，表明该区域存在一种新的耐药相关基因。此外，使用外显子捕获法分离了该区域的 60 个外显子。其中，有六个编码膜蛋白的基因，被认为作为药物转运蛋白参与药物敏感性。上述结果证明了基于YAC导入的表达系统的有用性，但为了将其应用于表达克隆，有必要提高导入效率并检查插入位点无关表达的通用性。因此，为了进一步发展之前的成果并将其有效地应用到广泛的系统中，我们将1.开发一种在循环化后引入YAC的方法，避免引入YAC时任意幂，并提高效率，2.它是。认为有必要检查通过其他基因克隆的甲基化选择性表达引入基因的普遍性。