新規ヒト人工染色体ベクターを用いたATM遺伝子欠損細胞の機能相補

使用新型人类人工染色体载体对 ATM 基因缺陷细胞进行功能互补

• 批准号: 04J02154
• 负责人: 綾部 文明
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Tottori University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J02154/
• 关键词: ヒト人工染色体ベクター; ゲノム遺伝子導入; TARクローニング法; 環状YAC; Cre; loxPシステム; HAC; ATM; 転写後調節

これまでにヒト21番染色体上の既知遺伝子を排除したヒト人工染色体(HAC)ベクターを構築し,ヒト・マウス細胞内での安定保持,導入GFP遺伝子の発現,HACを保持する幹細胞における分化誘導,分化によるHAC上の導入遺伝子の発現変化を示した.既存のウイルスベクターでは不可能である導入できるDNA長に制限がないことを示す目的で,ATの原因遺伝子ATMを発現制御領域を含むゲノムレベルで導入することを試みている.出芽酵母の相同組換えを利用したTARクローニング法により,線状YAC-ATM(His-/Ura+)から環状YAC-ATM(His+/Ura-)としてゲノムATMを単離し,Cre/loxPシステムによりHACベクターに遺伝子導入できる.His-プレート上で生存可能な表現型から選別した候補478クローンより,ATM遺伝子領域付近のSTSマーカーを用いてPCRスクリーニングを行い,14クローンの候補を得た.候補クローンをサザンブロットにより解析したところ,目的のATM遺伝子全長を保持する環状YACは見られなかった.そこで環伏YAC-ATMを構築するためのTARベクターの組換え効率向上を目指し,標的配列を散在性反復配列Aluに変更した.さらにTARベクターの自己環状化による形質転換体を除くため,ARSを持たないTARベクターを構築した.同時に体細胞遺伝学でよく利用されるヒトHPRT遺伝子を環状YACとして単離し,HACに導入して発現解析を行った結果,TARクローニング法を用いてゲノムDNAを環状化できること,HAC上に導入したゲノム遺伝子は断片化することなく正常に発現し,欠損細胞の機能を相補できることが確認できた.今後はゲノムATM遺伝子をHACに導入し,複数のアイソフォームによる転写後調節とATMタンパク機能との関係を調べる.

到目前为止，我们已经构建了人造染色体（HAC）载体，该载体排除了人类染色体上的已知基因，并在人和小鼠细胞中表现出稳定的保留，转基因在HAC上的表达在HAC上的表达，诱导携带HAC的干细胞分化，并改变了由于分化而改变HAC的表达。为了证明可以引入的DNA长度没有限制，而现有病毒载体是不可能的，因此在包含表达控制区域的基因组水平上引入了AT的AT因子基因。可以通过使用萌芽酵母的同源重组来将基因组ATM从线性YAC-ATM（His+/ura-）作为圆形YAC-ATM（His+/ura-）隔离，并且可以使用CRE/LOXP系统将基因转移到HAC载体中。从从His-Plate上的可行表型中选择的478个候选克隆中，使用ATM基因区域附近的STS标记进行了PCR筛选。获得了14个克隆。通过Southern印迹分析候选克隆，没有发现圆形YAC携带感兴趣的ATM基因的全长。因此，目标序列将其更改为散射的重复序列ALU，旨在提高TAR载体的重组效率以构建环YAC-ATM。此外，为了消除由焦油矢量自传导引起的转化体，构建了无ARS的焦油矢量。同时，还保持了体细胞残基。通常用于电信中的人类HPRT基因被分离为圆形YAC，并进行了HAC，并进行了表达分析，并证实，可以使用TAR克隆方法对基因组DNA进行循环，并且该基因组基因在HAC中引入了HAC中的基因组基因在没有碎片的细胞中表达的基因组基因表达了正常表达，并且可以构成互补的细胞，并且可以进行互补的功能。将来，基因组ATM基因将被引入HACS，并将研究多种同工型转录后调节与ATM蛋白功能之间的关系。

项目成果

基礎から先端までのクロマチン・染色体実験プロトコール(編集/押村光雄 平岡泰)

染色质/染色体实验方案从基础知识到技巧（由 Mitsuo Oshimura 和 Yasushi Hiraoka 编辑）

• 发表时间: 2004
• 作者: Takayuki Mizuno;Tohru Nakano;Misako Takayasu;Hideki Takayasu;神里志穂子;神里志穂子;古川 康一;Shihoko Kamisato;神里 志穂子;加藤基伸;綾部文明
• 通讯作者: 綾部文明

Construction of a novel human artificial chromosome vector for gene delivery

• DOI: 10.1016/j.bbrc.2004.06.145
• 发表时间: 2004-08-20
• 期刊: BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS
• 影响因子: 3.1
• 作者: Katoh, M;Ayabe, F;Oshimura, M
• 通讯作者: Oshimura, M