巨大ヒトゲノム導入による機能解析

引入巨型人类基因组进行功能分析

基本信息

批准号：
08283218
负责人：
和田守正
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は巨大DNAのマニピュレーションに画期的威力を発揮できるYACテクノロジーを応用して、(1)YAC導入による機能解析、(2)導入YACの動態の解析、(3)導入効率の改善と発現クローニング法への応用を行なって、新しい側面からバイオサイエンスをサポートすることを目的とする。本年度は導入実験の対象として、ヒトMDR1遺伝子領域を用いて、以下の点について検討を加え実績を上げた。1)YACを用いることにより、いわゆる挿入位置効果を回避できるか?:MDR1のcDNAを用いた導入実験(Ueda et al.1988)によると、薬剤耐性トランスフェクタント/Neo^rトランスフェクタントの効率は0.06%である。今回ヒトMDR1遺伝子を持つYAC導入株を単離し解析したところ、全てのクローンでヒトMDR1遺伝子が発現し、制ガン剤ビンクリスチンに耐性を獲得していた。すなわち、YACを用いることにより導入DNAの挿入位置効果を回避できる可能性が示唆された。2)YAC導入法をどのようにシス制御機構解析に応用できるか?:導入株のいずれにおいても、導入ヒトMDR1遺伝子の増幅及び発現促進が認められたのに対し、マウスの内在性mdr遺伝子の発現、増幅は見られなかった。この選択的発現機構につきいくつかの可能性を検討した結果、DNAメチル化による制御が示唆された。5aza-CdR処理によりマウスの内在性mdr遺伝子の発現が誘導され、この可能性が確認されるとともに、YAC導入によるシス制御機構の解析の有効性が示された。3)移入効率上昇の試み:PEGより融合効率の上昇が期待されるリポゾーム・センダイウイルスフュージョンをYAC導入に応用するために、YACのリポゾームへの封入を試みたが剪断力によるDNAの断片化が避けられなかった。線状巨大DNAは剪断力に弱いというYAC DNAの存在状態そのものを根本的に見直す必要があると考えられた。今後、移入の効率を上昇させるために、YACを環状化した後導入する方法を開発する。そのために、酵母菌内で環状化させるためのベクターを構築する。

本研究应用在巨型DNA操作方面具有革命性力量的YAC技术，以（1）通过引入YAC来分析功能，（2）分析引入的YAC的动力学，以及（3）提高和表达引入效率。通过将其应用于克隆方法，从新的角度支持生物科学。今年，我们以人类MDR1基因区域为导入实验对象，进行了以下几点研究并取得了成果。 1）使用YAC能否避免所谓的插入位置效应？：根据使用MDR1 cDNA的导入实验（Ueda et al. 1988），耐药转染子/Neo^r转染子的效率为0.06%。当我们分离和分析YAC引入的携带人类MDR1基因的菌株时，我们发现所有克隆都表达人类MDR1基因，并且已经获得了对抗癌药物长春新碱的耐药性。换句话说，表明通过使用YAC可以避免引入的DNA的插入位置效应。 2)YAC导入方法如何应用于顺式调控机制分析？：在所有导入的菌株中，观察到导入的人MDR1基因的扩增和表达促进，而没有观察到表达或扩增。通过检查这种选择性表达机制的几种可能性，建议通过 DNA 甲基化进行控制。 5aza-CdR处理诱导小鼠内源性mdr基因的表达，证实了这种可能性，并证明了通过引入YAC来分析顺式调节机制的有效性。 3) 尝试提高转移效率：为了将脂质体-仙台病毒融合应用于YAC导入，与PEG相比，预计会提高融合效率，我们尝试将YAC封装到脂质体中，但由于剪切力而发生了DNA断裂。这是不可避免的。人们认为有必要从根本上重新考虑YAC DNA本身的存在状态，即线性巨型DNA抵抗剪切力的能力较弱。未来我们将开发一种在环化后引入YAC的方法，以提高转移效率。为此，构建了用于酵母环化的载体。