アンチセンス発現アデノウイルスを用いたトランスポーターの薬物体内動態制御機能評価

使用反义表达腺病毒评估转运蛋白药代动力学控制功能

基本信息

批准号：
14657615
负责人：
辻彰
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

1997年に我々が発見した有機カチオントランスポーターOCTN1は、腎刷子縁膜に存在することが想定されていながらその分子的実体が未だ不明である有機カチオン輸送体と、機能的に類似していることが遺伝子発現系を用いた解析により示されている。しかし腎以外の臓器における機能は未だ不明である。本研究ではアデノウイルスベクターを用い、in vivoでOCTN1に対するアンチセンス遺伝子を導入することでその遺伝子発現を抑制し、OCTN1の生理的役割を評価することを目的とした。マウスあたり2.4x10^9PFUの力価で、OCTN1アンチセンスをコードしたアデノウイルスを頸静脈投与したところ、2-3日後には肝において遺伝子導入マーカーの発現が見られた。RT-PCRにより、肝にOCTN1が存在すること、および導入したアンチセンスが発現していることを確認した。一方で14日後にはGFPの蛍光は消失していた。以上よりアンチセンス一過性導入の実験系を確立することができた。この系において単離肝切片を調製しOCTN1の典型的基質であるtetraethylammonium (TEA)の取り込みを検討したところ、顕著な取り込みが観察されたもののAdmOCTN1.ASの導入により肝臓への取り込みに顕著な変化は観察されなかった。また感染2日後のマウスに放射標識TEAを投与しその胆汁排泄を検討したところ、胆汁中のTEA回収量にも有意な変化は見られなかった。一方でセンス鎖をコードしたアデノウイルスを感染させた際には、以前に肝において基質の輸送活性が認められ、今回血液脳関門においても輸送活性の上昇を認めることができた。従って、本実験系はトランスポーターの持つ生物学的活性の評価や薬物デリバリーには有用である一方で、遺伝子ノックダウンによる生理的役割解明への応用にはさらなる検討が必要であると考えられる。

我们于 1997 年发现的有机阳离子转运蛋白 OCTN1 在功能上与假定存在于肾刷状缘膜中的有机阳离子转运蛋白相似，但通过使用基因表达系统的分析表明其分子身份仍然未知。。然而，其在肾脏以外的器官中的功能仍不清楚。本研究利用腺病毒载体在体内导入针对OCTN1的反义基因，抑制其基因表达，旨在评估OCTN1的生理作用。当编码 OCTN1 反义的腺病毒以每只小鼠 2.4x10^9 PFU 的滴度注入颈静脉时，2-3 天后在肝脏中观察到基因转移标记物的表达。通过RT-PCR，我们证实了肝脏中OCTN1的存在以及引入的反义链的表达。另一方面，14天后GFP荧光消失。综上所述，我们能够建立瞬时反义引入的实验系统。在该系统中，制备了分离的肝脏切片，并检查了 OCTN1 的典型底物四乙铵 (TEA) 的摄取，虽然观察到显着的摄取，但 AdmOCTN1.AS 的引入引起了肝脏摄取的显着变化。没有观察到。此外，当感染后2天对小鼠施用放射性标记的TEA并检查其胆汁排泄时，未观察到胆汁中回收的TEA量的显着变化。另一方面，当感染编码有义链的腺病毒时，之前在肝脏中观察到底物转运活性，这次我们也能够观察到血脑屏障处的转运活性增加。因此，虽然该实验系统可用于评估转运蛋白的生物活性和药物递送，但还需要进一步的研究来通过基因敲低来阐明生理作用。