ヒト赤血球プロテインホスファターゼ2Aの活性制御機構の研究

人红细胞蛋白磷酸酶2A活性调控机制研究

基本信息

批准号：
07670145
负责人：
武田誠郎
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒト赤血球可溶画文よりサブユニツト構造の異なる4種のプロテインホスファターゼ2A(PP2A);α_1β_1,α′_1β_1、α_1β_1γ_1、α_1β_1δ_1を分離精製した。αとα′(34kDa)は触媒サブユニツトで、β(63kDa)、γ(53kDa)、δ(74kDa)は調節サブユニツトである。1)PP2Aの触媒サブユニツトに含まれる2価金属イオンの同定:αとα′は蛋白化学的に区別出来ない。αは2価金属イオンが無くとも活性があり、Mg^2+またはMn^2+によって活性化を受ける。α′は完全にMn^2+依存性でMg^2+のみではほとんど活性がない。αにはこれらの2価金属は含まれないが,等モルのZnと0.3モルのFeが検出された。α′にはこれらの金属は検出されなかった。2)PP2Aホロ酵素、α_1β_1δ_1の再構成によるδの機能分解:α_1β_1δ_1をヘパリン-セファローズカラムを用いてα_1β_1とδ_1に分離し、両者を食塩存在下で混和し、ホロ酵素を再構成した。各種リン酸化タンパク室を基質としたα_1β_1のホスファターゼ活性はδが結合することにより20-64%抑制された。この性質を利用してδの定量法を確立した。3)74kDaδのcDNAの単離と推定一時構造:δの部分アミノ酸配列に基づいて、ヒト大脳皮質cDNAライブラリーからδをコードするcDNAを単離した。この塩基配列からδは570個のアミノ酸からなる分子量66万の蛋白質と推定された。δの一次構造はPP2AのB′サブユニットとの類似性が認められた。δにはAキナーゼ、Cキナーゼによるリン酸化部位のコンセンサス配列が複数存在し、N末端側にはPQ繰り返し配列、C末端側に核移行シグナル、SH3との結合部位のコンセンサス配列が存在した。ノーザン・ブロットで調べた全ラット組織に約2.9kbのδのmRNAの発現を認めた。これはウエスタン・ブロットによるδの組織分布と一致した。

从人红细胞可溶性组分中分离纯化出四种不同亚基结构的蛋白磷酸酶2A（PP2A）：α_1β_1、α′_1β_1、α_1β_1γ_1和α_1β_1δ_1。 α 和 α' (34kDa) 是催化亚基，β (63kDa)、γ (53kDa) 和 δ (74kDa) 是调节亚基。 1）PP2A催化亚基中所含二价金属离子的鉴定：α和α'与蛋白质化学无法区分。即使在没有二价金属离子的情况下，α 也具有活性，并被 Mg^2+ 或 Mn^2+ 激活。 α′完全依赖于Mn^2+，单独使用Mg^2+几乎没有活性。 α不含这些二价金属，但检测到等摩尔的Zn和0.3摩尔的Fe。 α' 中未检测到这些金属。 2）通过PP2A全酶α_1β_1δ_1的重构对δ进行功能性分解：使用肝素-琼脂糖柱将α_1β_1δ_1分离成α_1β_1和δ_1，并在氯化钠存在下将两者混合以重构全酶。以各种磷酸化蛋白室为底物的α_1β_1的磷酸酶活性通过与δ结合而被抑制20-64%。利用这一性质，我们建立了一种量化 δ 的方法。 3）74kDaδ的cDNA分离和估计临时结构：根据δ的部分氨基酸序列，我们从人大脑皮层cDNA文库中分离了编码δ的cDNA。根据该碱基序列，推测δ是由570个氨基酸组成、分子量为66万的蛋白质。发现 δ 的一级结构与 PP2A 的 B' 亚基相似。 δ 具有 A 激酶和 C 激酶磷酸化位点的多个共有序列、N 端的 PQ 重复序列、核定位信号以及 C 端与 SH3 结合位点的共有序列。通过 Northern blot 检测，所有大鼠组织中均表达约 2.9 kb δ mRNA。这与 Western blotting 测定的 δ 组织分布一致。