プロテインホスファターゼ2Aの74KDa調節サブユニットδの構造と機能

蛋白磷酸酶2A 74KDa调节亚基δ的结构和功能

基本信息

批准号：
07680652
负责人：
碓井裕史
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.ヒト赤血球サイトゾルより精製した分子量180,000のプロテインホスファターゼ2Aは,34kDaの触媒サブユニットαと63および74kDaの調節サブユニットβ,δを各1分子ずつ含有する。74kDaδサブユニットの部分アミノ酸配列を決定し,ヒト大脳皮質および骨髄cDNAライブラリーよりδサブユニットのcDNAを単離した。このcDNAは570残基のアミノ酸より構成される分子量66,138の蛋白質をコードしており,大腸菌に発現させるとδサブユニット特異抗体と反応する約74kDaの蛋白質が検出された。推定される1次構造にはAキナーゼおよびCキナーゼによるリン酸化コンセンサス配列,核移行シグナル,プロリンリッチ領域,プロリン・グルタミンくり返し配列が認められた。δサブユニットのmRNAは約2.9kbで成熟ラットの調べた全ての組織(脳,心臓,肺,肝臓,脾臓,腎臓,腸,精巣,骨格筋)で検出された。:2.成熟ラットにおけるδサブユニットの組織分布をウエスタンブロット法で調べた。赤血球,脳,肺,精巣,副腎,心臓,脾臓,腎臓,肝臓のサイトゾルにδサブユニット特異抗体と反応する72kDa蛋白質が検出され,この内,脳における含量が最も多かった。骨格筋,腸ではほとんど検出されなかった。3.δサブユニットの機能をホロ酵素α_1β_1δ_1の解離,再構成により解析した。部分精製したα_1β_1δ_1をヘパリン-セファロースカラムを用いてα_1β_1とδに分離した。両者を0.4M塩化ナトリウム存在下で氷中で混和すると,ホロ酵素が再構成された。各種リン酸化基質に対するα_1β_1のホスファターゼ活性はδが結合することにより20-64%抑制され,α_1β_1およびα_1β_1δ_1の分子活性から推定されたδの機能を裏付けた。

1.从人红细胞胞浆中纯化得到的分子量为180,000的蛋白磷酸酶2A含有34 kDa的催化亚基α和63和74 kDa的调节亚基β和δ各一个分子。测定了74kDaδ亚基的部分氨基酸序列，并从人大脑皮层和骨髓cDNA文库中分离出了δ亚基cDNA。该cDNA编码由570个氨基酸残基组成的分子量为66,138的蛋白质，当在大肠杆菌中表达时，检测到与δ亚基特异性抗体反应的约74kDa的蛋白质。预测的一级结构包括 A 激酶和 C 激酶的磷酸化共有序列、核输出信号、富含脯氨酸的区域和脯氨酸-谷氨酰胺重复序列。 δ 亚基 mRNA 约为 2.9 kb，在成年大鼠的所有检查组织（脑、心脏、肺、肝脏、脾、肾、肠、睾丸和骨骼肌）中均检测到。 :2.通过Western blotting研究成年大鼠δ亚基的组织分布。在红细胞、脑、肺、睾丸、肾上腺、心脏、脾、肾和肝脏的胞浆中检测到与δ亚基特异性抗体反应的72kDa蛋白，其中在脑中含量最高。在骨骼肌和肠道中几乎检测不到它。 3.通过全酶α_1β_1δ_1的解离和重构分析δ亚基的功能。使用肝素-琼脂糖柱将部分纯化的α_1β_1δ_1分离为α_1β_1和δ。当两者在 0.4M 氯化钠存在下在冰上混合时，全酶被重构。通过与δ结合，α_1β_1对各种磷酸化底物的磷酸酶活性被抑制20-64%，支持从α_1β_1和α_1β_1δ_1的分子活性估计的δ的功能。