ヒト赤血球タイプ2Aプロテインホスファターゼの活性調節機構の研究

人红细胞2A型蛋白磷酸酶活性调节机制研究

基本信息

批准号：
05670142
负责人：
碓井裕史
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒト赤血球に、当教室で新たに見い出したタイプ2Aプロテインホスファターゼはα_1β_1δ_1のサブユニット構造を持ち、α(34kDa)が触媒サブユニット、β(63kDa)とδ(74kDa)が調節サブユニットである。本年度は74kDaδサブユニットの機能解析のための基礎的実験を重点的に行った。純化したα_1β_1δ_1からδとα_1β_1をヘパリン・セファローズカラムを用いて分離した。δとα_1β_1を0.5M NaCl存在下で混合し、α_1β_1δ_1とα_1β_1を完全に分離し得る条件でスーパーデラックス200のゲル濾過を行うと、一部α_1β_1δ_1が再構成された。一方、δはA-キナーゼまたはC-キナーゼでリン酸化されることを当教室で明らかにしているので、δとα_1β_1の結合に及ぼすδのリン酸化の影響を見た。その結果、A-キナーゼによるδのリン酸化が、δのα_1β_1への結合を促進することを見い出した。現在、再構成されたα_1β_1δ_1の性質を詳細に調べている。他方、δの組織分布やcDNAクローニングのために、δに対する抗体を作製した。上述の方法で単離したδをリビ・アジュバンドシステムを用いてマウスの腹腔に投与し、δに特異的な抗体を得た。この抗体はラットの70〜72kDaのタンパク質と特異的に反応する。ウエスタンブロット法で、これらのタンパク質の組織、細胞内分布を解析中である。一方、この抗体を用いてヒト骨髄cDNAライブラリーからこの抗体と反応するタンパク部分に対応するDNA断片を含むクローンをスクリーニング中である。δのcDNAのクローニングによる一次構造の決定、δのcDNAをプローブとしたノーザンブロット法によるδのmRNAの組織分布、δとα_1β_1の解離、再構成によるδのリン酸化の意義を明らかにし、δの機能を解明する。

我们在人红细胞中新发现的2A型蛋白磷酸酶，其亚基结构为α_1β_1δ_1，其中α（34kDa）是催化亚基，β（63kDa）和δ（74kDa）是调节亚基。今年，我们重点关注 74kDaδ 亚基功能分析的基础实验。使用肝素-琼脂糖柱从纯化的 α_1β_1δ_1 中分离 δ 和 α_1β_1。当δ和α_1β_1在0.5M NaCl存在下混合并使用Super Deluxe 200在允许α_1β_1δ_1和α_1β_1完全分离的条件下进行凝胶过滤时，α_1β_1δ_1的一部分被重构。另一方面，由于我们实验室已经证明δ被A-激酶或C-激酶磷酸化，因此我们研究了δ的磷酸化对δ和α_1β_1之间结合的影响。结果，我们发现A-激酶对δ的磷酸化促进了δ与α_1β_1的结合。我们目前正在详细研究重建的 α_1β_1δ_1 的属性。另一方面，为了研究δ的组织分布和cDNA克隆，我们产生了针对δ的抗体。将通过上述方法分离的δ使用Livi佐剂系统腹腔注射给小鼠以获得δ特异性抗体。该抗体与 70-72 kDa 的大鼠蛋白发生特异性反应。我们目前正在使用蛋白质印迹分析这些蛋白质的组织和细胞内分布。与此同时，我们目前正在利用这种抗体筛选人骨髓 cDNA 文库，寻找含有与该抗体反应的蛋白质部分相对应的 DNA 片段的克隆。我们通过克隆δ cDNA确定了δ的一级结构，以δ cDNA为探针通过Northern印迹阐明了δ mRNA的组织分布，并通过δ和α_1β_1的解离和重建阐明了δ磷酸化的意义。功能。