ヒト赤血球プロテインホスファターゼ2Aの活性制御に関する研究

人红细胞蛋白磷酸酶2A活性调控的研究

基本信息

批准号：
06670141
负责人：
武田誠郎
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒト赤血球可溶画分よりサブユニット構造の異なる4種のオプロテインホスファターゼ2A(PP2A):α_1β_1,α'_1β'_1,α_1β_1γ_1,α_1β_1δ_1を分離精製した。αとα'(34kDa)は触媒サブユニットでβとβ'(63kDa),γ(53kDa),δ(74kDa)は調節サブユニットである。α'_1β'_1はMn^<2+>依存性PP2Aであり,α'とα,β'とβはそれぞれ蛋白化学的に区別出来ない。α_1β_1は2価金属イオンが無くとも活性があり,Mg^<2+>またはMn^<2+>によって活性化を受けるが,α'_1β'_1は完全にMn^<2+>依存性でMg^<2+>のみでほとんど活性がない。この性質の違いはαとα'の違いによる。一方,δをリビ・アジュバンドシステムを用いてマウスの腹腔に投与し,δに特異的な抗体を得た。この抗体と反応する蛋白質のラットにおける組織分布をウエスタンブロット法で検討した。その結果,赤血球,脳,心臓,肺,副腎,精巣の可溶画分に単一の70kDa抗体反応蛋白質を認めた。特に含量の多い脳可溶画分よりこの蛋白質を精製した。この蛋白質は,ヒト赤血球α_1β_1δ_1と類似のサブユニット構造を持つ分子量約16万のPP2Aの調節サブユニットであることが判明した。したがってラットでは74KDaδに相当する70kDa調節サブユニットが赤血球のほかに脳に多く分布することがわかった。他方,すでに決定したδの部分アミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを作成し,HeLa細胞より合成したcDNAを鋳型としてPCR法でδをコードする0.5kbのcDNA断片を単離した。この断片をプローブとしてヒト大脳由来のλZAPcDNAライブラリー30万クローンをスクリーニングして6個の陽性クローンを単離した。このうちδの全長をコードすると思われる2.9kbのインサートを有するクローンよりその塩基配列を決定した。これから明らかになったδの一次構造は,他のサブユニットの一次構造との類似性が乏しく,δが独自の機能を有するものと想像された。

从人红细胞可溶性组分中分离纯化出四种不同亚基结构的蛋白磷酸酶2A（PP2A）：α_1β_1、α'_1β'_1、α_1β_1γ_1和α_1β_1δ_1。 α 和 α' (34kDa) 是催化亚基，β 和 β' (63kDa)、γ (53kDa) 和 δ (74kDa) 是调节亚基。 α'_1β'_1是Mn^2+依赖性PP2A，并且α'和α、以及β'和β是化学上无法区分的蛋白质。 α_1β_1 即使在没有二价金属离子的情况下也具有活性，并且可以被 Mg^<2+> 或 Mn^<2+> 激活，但 α'_1β'_1 完全依赖于 Mn^<2+> 仅 Mg^<2。 +> 几乎没有任何活动。这种性质的差异是由于α和α'之间的差异造成的。同时，利用Livi佐剂系统对小鼠腹腔注射δ，获得了针对δ的特异性抗体。使用蛋白质印迹法研究了大鼠体内与该抗体反应的蛋白质的组织分布。结果，在红细胞、脑、心脏、肺、肾上腺和睾丸的可溶部分中发现了单一的 70kDa 抗体反应蛋白。这种蛋白质是从脑可溶性部分中纯化出来的，含量特别高。该蛋白被发现是PP2A的调节亚基，分子量约为16万，亚基结构与人类红细胞α_1β_1δ_1相似。因此，在大鼠中，发现与74KDaδ对应的70kDa调节亚基大量分布在大脑和红细胞中。另一方面，基于先前确定的δ的部分氨基酸序列创建寡核苷酸引物，并使用从HeLa细胞合成的cDNA作为模板，通过PCR分离编码δ的0.5kb cDNA片段。以该片段为探针，我们筛选了30万个人脑来源的λZAP cDNA文库克隆，分离出6个阳性克隆。在这些克隆中，核苷酸序列是从带有 2.9 kb 插入片段的克隆中确定的，该插入片段被认为编码了 δ 的全长。已阐明的δ的一级结构与其他亚基的一级结构几乎没有相似之处，因此推测δ具有独特的功能。